litceysel.ru
добавить свой файл
1
ДОКЛАД 4.



Ройдер Й.


Молекулярные основы антиVEGF-терапии ВМД.

(стенограмма)


г. Киль, Германия


Уважаемый доктор Иванишко, уважаемые коллеги, председатель! Я очень рад присутствовать в Ростове во второй раз и вступать в научные дискуссии со специалистами из России. Сейчас мы вступаем фактически в новую эру, в новое десятилетие, когда очень большое внимание уделяется интравитреальным инъекциям.

Сейчас уже известно, что фактор VEGF, т.е. фактор роста сосудов – это самый важный ангиогенный фактор. Сейчас этот фактор активно используется в лечении ВМД, но пока нет полного понимания механизма действия.

Но существуют общие принципы физиологии, как эти факторы влияют на реакцию. Например, в случае ИЛ-2, т.е. идёт воздействие на рецептор, возникает каскад и возникает в дальнейшем индукция генов. Соответственно, и в случае кортизона возникает реакция на рецептор, каскад, и уже стимуляция внутриклеточных генов. Этот фактор VEGF - это не одна молекула. Существует несколько его форм, 5 изоформ и ещё 4 вида. Фактически, фактор VEGF существует в нескольких изоформах, которые являются результатом альтернативного сплайсинга генов. Есть различные формы, которые представлены слева в столбике. Эти различные изоформы имеют неодинаковую растворимость в гепарине и в воде в связи с тем, что они по-разному связываются с гепарином.

Форма VEGF-165 является самой важной формой и, в частности, препарат макуген, он специфически связывается именно с этой формой. Напротив, люцентис и авастин связываются со всеми изоформами. Если VEGF поступает в клетку, он связывается со специфическим рецептором, который называется тиразинкиназа. Это совершенно специфический рецептор именно для VEGF.

Таким образом, существуют домены, т.е. места связывания – экстрацеллюлярные и интрацеллюлярные. К сожалению, для VEGF не существует одного рецептора, их всего 4. Соответственно – VEGF-1, VEGF-2 и VEGF-3 рецептор, и, справа, называется NRP-1. Т.е., соответственно, и возникает определённый путь сигнала. Т.о., VEGF идёт к рецептору, активирует его и возникает ангиогенез. И вот, как здесь представлено на слайде, возникает неоваскуляризация. Т.о., как сейчас существует представление у фармацевтических компаний, VEGF именно взаимодействует с рецепторами. И считается, что под воздействием антиVEGF-препаратов хориоидальная неоваскуляризация должна развиваться обратно.


В нашем исследовании мы хотели выяснить, насколько соответствует действительности это представление, и какое возможно различие в механизмах действия трёх лекарств. И мы хотели понять, есть ли разница между авастином и люцентисом и исследовать эту возможную разницу in vitro.

Использовалась специальная перфузионная органная камера, взятая от свиньи. Здесь вы видите среду, которая поступает в специальный прибор, происходит нагрев ткани до 37-40 градусов. Среда под действием аспирационно-ирригационной системы выкачивается в устройство, которое справа расположено. Здесь показана схема этой экспериментальной установки: это хориоидальная ткань и сетчатка. Т.о., данная экспериментальная установка позволила нам собрать достаточное количество этого фактора, VEGF.

Органная культура подвергалась воздействию авастина, люцентиса и макугена в концентрациях, которые представлены на слайде. Эти концентрации сопоставимы с теми, которые используется в клинике. Тот материал, который выходил, он подвергался обработке и анализу методом Эллиса.

Итак, результаты. Прежде всего, очень важный факт, что в органной культуре происходит экспрессия этого фактора. Препарат бевацизумаб и ранибизумаб, они полностью блокировали этот фактор. Слева вверху чёрным – это контроль, справа ранибизумаб. Очень интересно у нас получилось, что макуген не ингибировал VEGF. И вот объяснение этому факту: VEGF имеет несколько доменов, т.е. локусов. Есть специальный домен, который связывается с рецептором, и рецептор, который связывается с гепарином. Авастин и люцентис, они блокируют только домен, который связан с рецептором, а этот домен очень важен для контакта с рецептором. А макуген связывается только с гепариновым доменом. Это объяснение тому, почему макуген не работает, как остальные препараты. При прямом сравнении оказалось, что люцентис в 20-30 раз более эффективен, чем авастин. И это объясняет иногда, почему в парном глазу тоже бывает эффект. Т.е. фактически мы всегда используем слишком большую дозу, больше, чем нам нужно.


Ещё интересное наблюдение: блокировка происходит в течение 16 часов. У нас есть перфузионная камера, в которой происходит постоянное присутствие среды, а среда, она разбавляется. И через определенное количество времени, около 14 часов, уменьшается концентрация. Вот в частности, авастина становится 42нгр., а люцентиса – ещё меньше, 21нгр. И при прямой экспозиции дозы, 42нгр. авастина или 21нгр. люцентиса, ингибирование VEGF не происходит. Вообще-то это очень интересно, потому что должен был бы быть какой-то другой дополнительный механизм действия, который и обеспечивает вот это ингибирование. Возможно, здесь есть неспецифическое связывание с тканью. Однако, по данным иммуногистологии мы не обнаружили связывания авастина с клетками. Т.е. здесь должен быть прямой эффект.

Мы исследовали концентрацию VEGF в клетках пигментного эпителия. Мы обнаружили, что авастин и люцентис снижают содержание VEGF-факторов в клетках эпителия, именно интрацеллюлярно. Итак, сейчас мы думаем над рабочей гипотезой. Какое возможно объяснение? Может, механизм обратной связи либо здесь идёт обратный захват? Вот как раз к вопросу об обратном захвате в клетках, впервые об этом сказал доктор Хайдушко в 2007году.

Т.о. резюмирую: механизм действия этих препаратов сложнее, чем пытаются представить фармацевтические компании. Есть новые механизмы воздействия этих препаратов на пигментный эпителий.

Мы также провели ещё другой эксперимент. Имеется перфузионная камера, имеется монослой клеток пигментного эпителия. Поверх монослоя клеток располагается слой декстрана, который в норме, при нормальных клетках, не проходит через них. А декстран обнаруживается флюоресцентными методами. Если какое-то воздействие осуществить на клетки, например, повредить их, то декстран начнёт проходить через слой клеток. И результаты: флюоресциновый спектр декстрана на 1,2 и 9 дни. Если, допустим, на первый день мы произвели инъекцию, например, триамцинолона, авастина или люцентиса, то происходит повышенное проникновение декстрана через монослой. После инъекции люцентиса состояние достаточно быстро возвращается к норме. При инъекции авастина – ситуация несколько другая: здесь больше восстанавливается нормальная проницаемость. А если вы добавите дополнительно ещё триамциналон в систему, происходит защитный эффект на клетке. Т.о. мы показали, что люцентис и авастин ослабляют тесные контакты между клетками.


Наша гипотеза основывается на том, что воздействие происходит на уровне белков аклюдина либо актина. Вот, например, здесь показан стресс клеток, внизу триамциналон, справа – время возвращения к норме. Результаты тестов проницаемости: получается, что авастин и люцентис увеличивают проницаемость (статистически значимо) клеток пигментного эпителия в первый день. А триамциналон как бы снимает этот эффект. Совместная инъекция триамциналона с авастином либо люцентисом приводит к стабилизации проницаемости в определенные дни наблюдения. Эти результаты могут объяснить, почему разрывы пигментного эпителия возникают более часто на глазах, на которых производится антиангиогенное лечение. В случае авастина это бывает чаще, чем при люцентисе.

Ещё интересное такое наблюдение. Если вы добавите триамциналон к люцентису или к авастину, концентрация VEGF идёт вниз. Т.е. показано, что в определённые дни наблюдения, на второй, третий день, триамциналон вместе с авастином либо люцентисом приводит к уменьшению концентрации факторов VEGF в сравнении с просто авастином или люцентисом. Т.о. получается, что триамциналон усиливает эффект авастина и люцентиса. Т.е. чем глубже мы рассматриваем проблему, тем больше у нас возникает вопросов.

Заключение: авастин и люцентис имеют дополнительный внутриклеточный эффект воздействия на клетки. Вообще, ситуация более сложна, чем нам представлялось раньше. Эффект длится дольше, чем это теоретически возможно. Люцентис более эффективен, чем авастин. Плотные соединения между клетками при введении люцентиса и авастина ослабляются, и возникают разрывы в сетчатке. Триамциналон усиливает антиангиогенный эффект люцентиса и авастина.

Большое спасибо за внимание. И хотел бы добавить, что я не получаю денег от компании Novartis. Спасибо. (Аплодисменты).


Нероев В.В.: Спасибо. Пожалуйста, вопросы. Пожалуйста, профессор Балашевич.

Балашевич Л.И.: Скажите пожалуйста, профессор Ройдер, у Вас очень интересное исследование, спасибо Вам за доклад. Где Вы проводите ваши исследования? У Вас есть своя биохимическая лаборатория, или на какой базе?


Ройдер Й.: Все исследования проводятся в нашей лаборатории, но делают это специальные люди, биохимики, которые были привлечены к этому исследованию. Т.е. фактически сейчас уже у меня больший крен идёт от гистологии к биохимии.

Островский М.А.: Почему, в принципе, в органной культуре появлялся фактор VEGF? Вот такой общий вопрос.

Ройдер Й.: Что хорошего в органной культуре? Это то, что она функционирует достаточно долгое время. Например, мы знаем, что сетчатка и хориоидальная ткань – они сохраняются много дней. И клетки находятся в своей естественной среде. Поскольку сохраняются почти нормальные физиологические условия, то и продуцируется фактор VEGF. Вообще, когда мы начинали исследование, мы не были уверены, что будут так происходить события, что будет фактор VEGF производиться. Но теперь, когда уже есть такие результаты, мы считаем, что это и есть доказательство, что эта экспериментальная схема работает.

Островский М.А.: Понятно, что этот фактор VEGF появлялся. Но почему это происходило?

Ройдер Й.: Конечно, мы только можем рассуждать на эту тему. Мы знаем, что пигментный эпителий продуцирует VEGF. Это, в общем-то, естественный нормальный физиологический механизм, т.е. клетки пигментного эпителия продуцируют фактор для того, чтобы поддерживать сосуды. Если происходит нарушение пигментного эпителия, происходит окклюзия хориокапилляров. Это естественная функция пигментного эпителия – продуцировать VEGF и поддерживать хориокапилляры.

Нероев В.В.: Пожалуйста, вопрос первого вице-спикера, профессор Иванишко.

Иванишко Ю.А.: Несколько сумбурный вопрос. Прошу сразу простить. Скажите, вот те механизмы лечебного действия, о которых Вы сегодня говорили. Как их можно сравнить по значимости для терапевтического эффекта при интравитреальном введении? Я имею в виду авастин и люцентис, исходя из их различия в молекулярном весе, размере молекулы и, следовательно, проницаемости через сетчатку. Вот что всё-таки играет бόльшую роль? Меньшая проницаемость, или, как раньше считали, непроницаемость сетчатки для авастина из-за в три раза большей по размерам молекулы и других характеристик? Как их можно сравнить? Весомость этих факторов? Один к трем? Один к четырем? Или…?


Ройдер Й.: Я считаю, что Вы важный момент затронули. Но мы теперь знаем, что разницы в проницаемости нет, т.е. авастин все-таки проходит через сетчатку. Эти эксперименты несколько раз были проведены: авастин полностью идёт через сетчатку.

Сдобникова С.В.: Я можно на две части, чтобы он не был очень громоздким. Из Ваших предшествующих исследований следует, что пигментный эпителий имеет большое значение в патогенезе макулярного отёка. В этой работе Вы получили результаты, свидетельствующие о том, что триамцинолон уменьшает проницаемость пигментного эпителия, а авастин увеличивает проницаемость.

Ройдер Й.: Вы говорите об отёке при диабете?

Сдобникова С.В.: Да. А вопрос мой заключается в том, что клинические исследования показывают, что и триамциналон, и авастин эффективны в лечении макулярного отёка. Как Вы это объясните?

Ройдер Й.: У нас есть опыт в лечении, использовании и авастина, и триамциналона при диабете. Т.е эффект авастина кратковременный, а триамциналона более длительный. Т.е. здесь в механизме действия не пигментный эпителий, а мюллеровские клетки задействованы, которые ответственны за возникновение макулярного отёка. Триамциналон производит окклюзию в пигментном эпителии. В частности, при диабетическом отёке мы часто думаем, что окклюзия именно пигментного эпителия является причиной отёка. Эти результаты как раз и объясняют, почему триамциналон может лучше работать, чем люцентис и авастин.

Нероев В.В.: Пожалуйста, профессор Бойко.

Бойко Э.В.: Профессор Ройдер, спасибо. Действительно классные такие исследования, экспериментальные. Но мне кажется, что вопрос будет интересен для всей аудитории. Мы блокируем факторы роста, а вместе с тем сосуды новообразованные, они регрессируют. Понятно, что новые расти не должны, но почему регрессируют старые новообразованные сосуды?

Ройдер Й.: Если я понял Вас правильно, что регрессируют новые сосуды, но не те, которые уже существовали прежде. VEGF ответственен за формирование новых сосудов, и это то, что нам нужно блокировать. Это также причина того, почему мы не находим окклюзию в перифовеальных сосудах.


Бойко Э.В.: Не совсем правильно, видно понят вопрос. Речь именно идёт о новообразованных сосудах. Почему спадаются? Почему проницаемость их уменьшается? Существующие новообразованные сосуды в макуле, допустим. Они регрессируют или только запустевают?

Ройдер Й.: Происходит окклюзия.

Бойко Э.В.: Почему?

Ройдер Й.: Я могу только предполагать, почему такая окклюзия происходит. Т.е. это обратная часть такого физиологического механизма: чтобы открыть сосуды, вам нужен VEGF. Поскольку, этот фактор ответственен не только за формирование сосудов, но и за их проницаемость. Но мы можем только рассуждать, предполагать…

Бойко Э.В.: Спасибо.

Нероев В.В.: Профессор Бирнгрубер.

Бирнгрубер Р.: Я думаю, что эта дискуссия очень важнá и очень интересна. Но насколько я знаю, понятно, что после этих антиангиогенных инъекций, вот эта неоваскуляризация не исчезает, а отёк уменьшается. И я вам в моём докладе покажу. Отёк исчезает. И поэтому острота зрения улучшается. Это происходит потому, что проницаемость этих новообразованных сосудов понижается за счёт этих антиангиогенных препаратов. Но эта неоваскуляризация сама по себе вовсе не изменяется. Эта причина, по которой вам нужно делать инъекции достаточно регулярно. Вы как бы тормозите это заболевание, останавливаете экссудацию...

Нероев В.В.: У нас небольшая дискуссия возникла…

Бойко Э.В.: Буквально одну минуточку. Но новообразованные сосуды предполагают проницаемость. Если мы не видим проницаемости… Допустим на флюоресцентной ангиографии или на оптической когерентной томографии мы видим, что всё исчезло, то это тогда уже не новообразованные сосуды.

Бирнгрубер Р.: Нет-нет. Я вам также покажу это на картинках, где будет очень ясно видно. Неоваскуляризация центральная: до и после этой инъекции. И там будет абсолютно нулевая разница.

Бойко Э.В.: Большое спасибо, будем ждать.


Нероев В.В.: Давайте дождёмся доклада профессора Бирнгрубера. А я, на правах ведущего, тоже задам вопрос. Профессор Ройдер, возможны какие-либо осложнения или негативное проявление передозировки авастина или люцентиса?

Ройдер Й.: Да, возможны. Мы пока не исследовали очень большие уровни, очень большие дозы. В экспериментах мы и так уже дозы увеличиваем, по сравнению с той дозой, которая реально используется, т.е. гораздо большие уровни, чем те, которые необходимы. Как я показал, необходима очень небольшая доза, и «лишняя» часть той введенной дозы люцентиса и авастина распределяется по всему организму. И фактически обсуждается вопрос… Частота инсультов, осложнения со стороны сердца возможно с этим связаны. Вообще, очень сложно как-то дифференцировать, потому что в этой возрастной группе уже изначально повышен риск этих осложнений. Я так считаю, что риска от передозировки нет. Для глаза именно. Но системные передозировки есть, риск не может быть исключен.

Балашевич Л.И.: Владимир Владимирович, вот к Вашему вопросу. У нас был один пациент, у которого после инъекции авастина наступила частичная атрофия хориокапилляриса. И мы так и не поняли, виноват ли авастин! Может, были там какие-то другие причины? Но зарегистрирована абсолютно чётко атрофия нормального хориокапилляриса, а не только новообразованного. Теоретически, вероятно, это возможно.

Нероев В.В.: Ну и мы знаем, что присутствуют случаи, как осложнение, повышения внутриглазного давления. Тоже надо следить за этим моментом. Но в целом мне ответ профессора Ройдера понятен. Ну что, будем ещё задавать вопросы? Профессор Хорошилова-Маслова, пожалуйста.

Хорошилова-Маслова И.П.: В своих экспериментальных исследованиях Вы обращали внимание, главным образом, на проницаемость ретинального пигментного эпителия. Но мы прекрасно знаем, что в основе отёков сетчатки лежит нарушение проницаемости гематоретинального барьера на уровне ретинальных капилляров, на уровне капиллярной стенки. Как влияют изучаемые Вами препараты именно на эту структуру? Потому что здесь тоже всё связано именно с характером взаимоотношений между клетками…

Ройдер Й.: Вы правы. Мы это не исследовали. Это, конечно, может быть было бы важно посмотреть… Но с другой стороны, открытие хориокапилляров, именно открытие, регулируется клетками пигментного эпителия. Но я воспринимаю Ваш комментарий, как стимул к действию. Спасибо.

Нероев В.В.: Большое спасибо, профессор Ройдер. Уважаемые коллеги, мы заслушали прекраснейшие, интереснейшие доклады по фундаментальным исследованиям. Сейчас по регламенту у нас кофе-пауза. И далее мы уже переходим к прикладным исследованиям, тоже очень интересным. Прошу всех отдохнуть, и в 12:35 начинаем работать.