litceysel.ru
добавить свой файл
1
Курсовая работа


студентки факультета биоинженерии и биоинформатики

МГУ им. М. В. Ломоносова

Александры Рязановой.

Тема:

Сравнение белковых последовательностей

рецепторов к простагландинам

и их изменение в процессе филогенеза.

Тьютор – д.х.н. Алевтина Трофимовна Мевх


Постановка задачи

Создание высокоселективных лигандов к рецепторам простагландинов

Простагландины участвуют в процессах воспаления, поддерживают сердечно-сосудистый гомеостаз. Отклонение их содержания в любую сторону от базового уровня является патологическим. Рецепторы к ним находятся на плазматической мембране и относятся к классическим G-белок-связывающим рецепторам. В настоящее время высокоселективные агонисты к простагландиновым рецепторам отсутствуют. Создание таких агонистов (или антагонистов) позволит разработать новые терапевтические стратегии по «точечному» изменению эффектов простагландинов. Для этого необходимы трехмерные модели этих рецепторов; а так как данных рентгеноструктурного анализа для них нет, большое значение приобретают биоинформатические методы исследования.

Выявление консервативных мотивов в лиганд-связывающем участке рецептора позволяет теоретически смоделировать его трехмерную структуру. Также возможно моделирование на основе уже известной трехмерной структуры другого белка, если его аминокислотная последовательность окажется достаточно похожей на последовательность нашего белка.


Реферат по теме: Простаноиды и рецепторы к ним


Простагландины и тромбоксаны.

Простагландины (PG) — это вещества с очень высокой биологической активностью. Синтезируются они почти во всех клетках организма. Спектр их действия необычайно широк: они контролируют сокращения гладкой мускулатуры (кровеносных сосудов, бронхов, матки), принимают участие в высвобождении продуктов внутриклеточного синтеза (гормонов, соляной кислоты, мукоидов), оказывают влияние на метаболизм костной ткани, периферическую нервную систему, иммунную систему, передвижение и агрегацию клеток (лейкоцитов и тромбоцитов), являются эффективными лигандами болевых рецепторов. Как правило, в одном типе клеток синтезируется один тип простагландинов, а в органе или ткани проявляется действие пары простагландинов-антагонистов, от соотношения концентраций которых зависит нормальное или патологическое состояние органа или ткани [1].


PG и тромбоксаны (TX) являются производными арахидоновой и дигаммагомолиноленовой кислот и называются простаноидами. У PGI есть и другое название — простациклин.

Далее рассматриваются рецепторы к 5 основным простаноидам: PGE2, PGF2, PGD2, PGI2 и TXA2.

Каждый простаноид связывается лучше всего с определенным видом рецепторов, названным в соответствии с этим (см. далее). Но пространственное строение разных простаноидов очень схоже, поэтому они способны связываться и с рецепторами «чужого» вида, хотя и с меньшим сродством.


Простаноидные рецепторы (PG-рецепторы).

PG взаимодействуют с G-белок-связывающими рецепторами, которые носят названия EP, FP, IP, TP и DP в зависимости от того, с какими простаноидами они связываются. Для PGE существуют 4 различных рецептора (подтипы EP1 – EP4), каждый из которых кодируется отдельным геном; связывание PGE с разными подтипами рецепторов обеспечивает различные (иногда противоположные) эффекты. Для каждого из PG-рецепторов были осуществлены клонирование и экспрессия соответствующего гена, охарактеризован белок [2].

G-белки (гуаниннуклеотидсвязывающие регуляторные белки) ответственны за передачу сигналов множества гормонов и нейромедиаторов к разнообразным мишеням клетки. Каждый из них имеет уникальные мишени. Два из них (Gi и Gs) контролиуют активность аденилатциклазы — фермента, катализирующего образование цАМФ. Gs-белки активируют аденилатциклазу, Gi-белки ее ингибируют. Среди PG-рецепторов есть связывающиеся и с Gs-белками, и с Gi-белками. G-белки прочно связаны с плазматической мембраной, но не являются трансмембранными [3].

PG-рецепторы содержат 7 гидрофобных трансмембранных сегментов, структура которых является типичной для всех G-белок-связывающих рецепторов (рис. 1 – 3). Эти трансмембранные сегменты, соединенные тремя внутри- и тремя внеклеточными петлями, образуют центральный домен рецептора. Переход конформации рецептора из неактивной в активную связан, по-видимому, с изменением пространственной ориентации 3-го и 6-го трансмембранных участков друг относительно друга. При этом изменяется конформация 2-ой и 3-ей внутриклеточных петель, которые важны для узнавания и активации G-белка; участок, с которым связывается G-белок, открывается для связывания [4].


В результате альтернативного сплайсинга у рецепторов, принадлежащих к одному типу, могут различаться внутриклеточные С-концы (это характерно для TP, FP, EP1 и EP3 рецепторов).

Строение EP4-рецептора человека схематично представлено на рис. 1 – 3. Положение и длина трансмембранных фрагментов, а также наличие дисульфидного мостика показаны в соответствии с данными из базы SwissProt.

PG-рецепторы принадлежат к семейству A, или классу А, G-белок-связывающих рецепторов (семейству родопсина). По данным филогенетических исследований это семейство разбивается на 5 эволюционно консервативных групп, PG-рецепторы относятся к 5-ой из них, вместе с многими другими веществами, выполняющими эндокринные, аутокринные и паракринные функции (трипептидами, гормонами гипофиза, гликопротеиновыми гормонами, опиоидами и фактором активации тромбоцитов). Особенно близки PG-рецепторы к семейству рецепторов вазопрессина. Несмотря на то, что вазопрессин является белком, его рецепторы оказываются ближе к PG-рецепторам, чем рецепторы, связывающиеся с низкомолекулярными лигандами (например, адреналином — производным тирозина) [2].

Передача сигнала PG-рецепторами осуществляется двумя различными путями: через стимуляцию фосфолипазы С с образованием инозиттрифосфата и диацилглицерина или через ингибирование аденилатциклазы.

Внутри семейства PG-рецепторов последовательности похожи на 20 – 30 %, 65 аминокислотных остатков консервативны. 34 аминокислотных остатка идентичны (абсолютно консервативны) для этого семейства; 14 из них — для всех G-белок-связывающих рецепторов, остальные 20 характерны только для PG-рецепторов. Большинство этих консервативных остатков («подписи» PG-рецепторов) располагаются внутри трансмембранных сегментов, хотя заметная часть их находится во 2-ой внеклеточной петле. В связывании лиганда участвуют и трансмембранные, и внеклеточные сегменты. Большинство работ, посвященных связыванию лиганда, показывает, что лиганд-связывающие участки PG-рецепторов можно объединить в один класс [2].


Важная черта PG-рецепторов — это существование альтернативно сплайсированной мРНК для 4 из 8 PG-рецепторов: TP, FP, EP1 и EP3. У всех них альтернативный сплайсинг наблюдается во внутриклеточном С-конце. Это не влияет на характеристики, касающиеся связывания лиганда, но влияет на специфичность связывания PG-рецептора с G-белком [2].

На данный момент G-белок-связывающие рецепторы исследуются очень активно. Это необходимо для фармацевтических целей: более 50 % существующих сегодня медикаментов действуют на G-белок-связывающие рецепторы [7]. Моделирование трехмерной структуры PG-рецепторов нужно для создания эффективных агонистов или антагонистов к этим рецепторам. К сожалению, кристаллизация трансмембранных белков — очень сложная задача, поэтому рентгеноструктурный анализ PG-рецепторов пока не сделан.

Молекулярная масса PG-рецепторов достаточно велика (превышает 39 кДа). Поэтому для теоретического моделирования трехмерной структуры этих рецепторов желательно выяснить, какие части молекулы участвуют в узнавании и связывании лиганда, чтобы моделировать только их. Для этого можно воспользоваться биоинформатическими методами: так как все простаноиды способны связываться со всеми типами PG-рецепторов, можно предположить, что аминокислотные последовательности PG-рецепторов достаточно схожи между собой. Это значит, что наиболее консервативные участки будут наиболее важны для поддержания конформации и связывания с лигандом.

Возможно построение трехмерной структуры PG-рецепторов на основе данных рентгеноструктурного анализа другого белка — в данном случае, родопсина быка. Но необходимо подтверждение правомерности такого подхода: доказательство того, что структура этих белков достаточно сходна. Для этого требуется, в частности, сравнение их аминокислотных последовательностей.

Кроме того, может быть полезным изучение аминокислотных последовательностей внутриклеточных фрагментов PG-рецепторов, так как эти фрагменты участвуют в связывании рецептора с G-белком. Можно предположить, что будет найдена группа консервативных аминокислотных остатков, расположенных в определенной части белка и ответственных за поддержание определенной структуры, необходимой для связывания с G-белком. С одним и тем же типом G-белка могут связываться разные рецепторы; в то же время PG-рецепторы разных типов, лиганды которых достаточно близки друг к другу, связываются с разными типами G-белков. Это значит, что важные для связывания с G-белком участки не входят в состав лиганд-связывающих участков.


На данный момент наиболее изученным из рецепторов к простагландину E2 является EP3-рецептор [2, 5, 6], имеющий 5 изоформ за счет альтернативного сплайсинга. Наименее охарактеризованным по свойствам и функциям из этой группы рецепторов является белок ЕР4-рецептора, который и является основным предметом нашего исследования. Основное сравнение проводится с EP3-рецептором.

ЕР4-рецептор человека — это белок из 488 аминокислотных остатков, его молекулярная масса составляет 53119 Да. В базе данных Swiss-Prot его ID — PE24_HUMAN; Accession number — P35408. Связывается он с Gs-белком.


1. Методы исследования

1.1. Частота встречаемости аминокислот в белках PG-рецепторов по сравнению с среднестатистической встречаемостью в белках человека. Сделано с помощью программы compseq пакета EMBOSS.

1.2. Поиск гомологичных белковых последовательностей проведен с помощью программ BLAST и PSI-BLAST (обе — с сервера NCBI) в базе данных SwissProt.

1.3. Множественные выравнивания белковых последовательностей сделаны с помощью программы ClustalW пакета EMBOSS. Парные выравнивания сделаны аналогично. Полученные множественные выравнивания потребовали дальнейшего редактирования вручную в программе GeneDoc.

1.4. Филогенетические деревья построены с помощью программ protdist, neighbor и drawgram из пакета программ PHYLIP (c сервера Института Пастера). Для визуализации 2 деревьев, вставленных в данный текст (на рис. 4 и 5) использована программа TreeView.


1.5. Информация о доменной структуре белка взята из базы данных Pfam.

1.6. Сравнение полученных результатов с базой данных по G-белок-связывающим рецепторам — GPCRDB (http://www.gpcr.org).


2. Результаты и обсуждение



2.1. Изучение белковых последовательностей простаноидных рецепторов.


2.1.1. Средняя частота встречаемости аминокислотных остатков в EP4-рецепторе человека, всех PG-рецепторах человека и вообще всех белках человека представлена в таблице 1.


Таблица 1.

Средняя частота встречаемости аминокислотных остатков в EP4-рецепторе человека, всех PG-рецепторах человека и вообще всех белках человека





Частота встречаемости а/к, %

А/к

в pe24_human

в PG-рецепторах человека

в белках человека

L

12,7

14,6

9,8


S

12,1

9,8

7,9

A

7,8

10,2

7,1

V

7,2

7,0

6,2

G

6,8

7,2

6,8

R

6,6

7,1

5,5

T

5,9

5,2

5,3

I

5,7

4,2

4,4

P

4,9

4,9

1,6

F

3,9


4,9

3,8

E

3,9

2,9

7,0

Q

3,5

3,2

4,6

D

3,1

2,2

4,9

N

2,9

2,4

3,7

Y

2,9

2,3

2,8

C

2,7

3,4

2,3

K

2,7

2,1

5,7

M

2,3

2,8

2,2

H


1,8

1,9

2,5

W

0,8

1,8

1,2

U

0,0

0,0

0,0

Из приведенных данных видно, что и в PG-рецепторах, и во всех белках человека наиболее часто встречаются 3 аминокислоты: лейцин, серин и аланин. Их частоты для EP4-рецептора и для PG-рецепторов (лейцина — 12,7 % и 14,6 %, серина — 12,1 % и 9,8 %, аланина — 7,8 % и 10,2 %, соответственно) заметно превышают среднестатистические для человека (9,8 %, 7,9 % и 7,1 %).

Если бы все аминокислоты встречались одинаково часто, доля каждой из них была бы равна 4,8 %. В EP4-рецепторе человека с частотой, большей этого значения, встречаются лейцин, серин, аланин, валин, глицин, аргинин, треонин, изолейцин и пролин (перечислены в порядке убывания частоты). Во всех PG-рецепторах человека с частотой, превышающей это значение, встречаются те же аминокислоты, за исключением изолейцина, и фенилаланин. Среднестатистические же результаты для всех белков человека показывают, что частота, большая, чем 4,8 %, характерна для всех вышеназванных аминокислот, за исключением изолейцина и фенилаланина, а также для глутаминовой кислоты, лизина и аспарагиновой кислоты.

Глутаминовая кислота, лизин и аспарагиновая кислота — гидрофильные аминокислоты, а изолейцин и фенилаланин — гидрофобные. Из трех наиболее частых аминокислот лейцин и аланин — также гидрофобные. То есть количество гидрофильных аминокислотных остатков в PG-рецепторах (трансмембранных белках), как и ожидалось, меньше среднестатистического; а количество гидрофобных — больше.



2.1.2. Для выявления консервативных участков в белковых последовательностях PG-рецепторов проведено их множественное выравнивание.

Множественное выравнивание сделано для близких гомологов EP3-рецептора человека. Для этого с помощью программы BLAST получен список из 34 белков; все они принадлежат млекопитающим (человек, обезьяна, собака, мышь, крыса, кролик, бык и свинья). E Value для этих белков — не более 2*10 –15; остальные белки, предложенные программой BLAST в качестве возможных гомологов, имели E Value не менее 4*10 –5. В число этих 34 белков входят все PG-рецепторы, лежащие в SwissProt (и только они). Проведено выравнивание их аминокислотных последовательностей.

Сравнение сделанного автоматически выравнивания с представленным в базе данных показало, что результаты значительно различаются (в выравнивании, выставленном в Интернете, больше консервативных аминокислотных остатков). От сведений, приведенных в статье [2], оно также отличалось меньшим чилом консервативных аминокислотных остатков. А авторы статьи [9] предупреждали, что автоматические программы плохо справляются с выравниванием большого числа трансмембранных белков. Поэтому было проведено редактирование выравнивания вручную в программе GeneDoc.

Мутации в трансмембранных участках (α-спиралях) менее вероятны, чем во вне- или внутриклеточных участках, поэтому при выравнивании трансмембранных белков стоит опираться прежде всего на консервативные аминокислоты в α-спиралях как на более достоверные. В основе редактирования лежал поиск мотивов, приведенных в статье [10], которые встречаются у большинства представителей семейства родопсиновых рецепторов (так называемых “отпечатков пальцев” — fingerprints):


  • G72N100 — в 1-ом трансмембранном участке;

  • L92XXXD91 — во 2-ом трансмембранном участке;
  • C94(17X)L79(5X)D80R98Y74 — в 3-ем трансмембранном участке и начале 2-ой внутриклеточной петли;


  • W86 — в 4-ом трансмембранном участке;

  • F49XXP77(7X)Y89 — в 5-ом трансмембранном участке;

  • F80XXC76W58XP73 — в 6-ом трансмембранном участке и

  • N86P97 — в 7-ом трансмембранном участке.

В этом списке нижние индексы — это проценты консервативности соответствующих аминокислотных остатков.

D во 2-ом трансмембранном участке, а также DRY (или ERW) в 3-ем трансмембранном участке и начале 2-ой внутриклеточной петли важны для активации рецептора. Они консервативны для всего семейства А и не консервативны для других семейств G-белок-связывающих рецепторов. Это позволяет считать, что изменение конформации центрального домена или процессы, приводящие к данному изменению конформации, различны для разных семейств [4].

Не все вышеперечисленные мотивы встречались у PG-рецепторов точно в таком виде. Непосредственно для PG-рецепторов абсолютно консервативными мотивами являются следующие:

  • GXXXNXXA — в 1-ом трансмембранном участке;

  • LXXXDXXG — во 2-ом трансмембранном участке;

  • L(8X)MXXE — в 3-ем трансмембранном участке;

  • LP — в 4-ом трансмембранном участке;

  • N(6X)L — в 5-ом трансмембранном участке;

  • CXXP — в 6-ом трансмембранном участке и

  • R(6X)IXDPW(5X)R — в 7-ом трансмембранном участке.

После такого редактирования число консервативных аминокислотных остатков увеличилось до 27. Они расположены

  • во всех 7 трансмембранных участках;

  • в 1-ой внутриклеточной петле;

  • в 1-ой внеклеточной петле;

  • во 2-ой внутриклеточной петле;

  • во 2-ой внеклеточной петле;

  • в 4 внутриклеточном участке.

Консервативные аминокислотные остатки показаны на рис. 1.


2.1.3. Сравнение последовательностей PG-рецепторов человека путем их множественного выравнивания с последующим ручным редактированием показало, что консервативными являются 28 аминокислотных остатков. Они отмечены на рис. 1. Это те же аминокислотные остатки, что и в предыдущем пункте, а также треонин-64 (выделен на рис. 1 серым цветом).


2.1.4. Сравнение последовательностей EP-рецепторов у млекопитающих путем их множественного выравнивания с последующим ручным редактированием показало, что консервативными являются 40 аминокислотных остатков (рис. 2). В их число входят все аминокислотные остатки, консервативные для PG-рецепторов.


2.1.5. Для выявления общих черт в строении более далеких гомологов PG-рецепторов проведено сравнение последовательностей типичных представителей семейства G-белок-связывающих рецепторов.

С помощью программы PSI-BLAST получен список белков — более далеких гомологов EP3-рецептора человека. Для построения выравнивания и филогенетического древа из него взяты первые 100 белков (E Value меньше 10 -66). Все они являются представителями класса А G-белок-связывающих рецепторов. Эти белки принадлежат уже не только млекопитающим (список белков и организмов, а также множественное выравнивание см. в Интернете, http://kodomo.cmm.msu.ru/