litceysel.ru
добавить свой файл
  1 ... 2 3 4 5 6
Глава 10. Сворачивание белка около рибосомы. Почему белки должны сворачиваться котрансляционно? Как известно, белковая цепь строится в пептидилтрансферазном центре рибосомы с N-конца, по одному аминокислотному остатку. Синтезируемая цепь продвигается далее по узкому рибосомному каналу и котрансляционно выходит из рибосомы в цитоплазму (рис.6).


Известно, что рибосомный канал заполнен водой, а его стенки обладают редгезивным свойством, – полипептидная цепь не прилипает к стенкам канала. Установлены размеры канала, которые составляют, по разным данным, по длине 50 - 100Å, и в диаметре 15 – 28Å. Известно также, что полипептидная цепь продвигается по каналу и выходит из него без резких изгибов в развернутом виде.




Рис.6. Схематическое представление синтезирующей полипептид рибосомы. (А)- узнающий антикодон участок, (Р)- пептидилтрансферазный центр, (Ex)-место выхода цепи из рибосомы. (Адаптирован из: Спирин, «Молекулярная биология» том 1 (1986).)




Обратим внимание на скорость выхода полипептидной цепи из рибосомы, т.е. скорость элонгации цепи на рибосоме. Средние скорости элонгации полипептидных цепей различных белков определены в разных клетках и при различных условиях в многочисленных экспериментах in vivo и на модельных системах. Определены также абсолютные скорости трансляции отдельных кодонов м-РНК в E.coli. Наибольшая скорость составила 21,6 кодонов/с, следовательно, наименьшее время для трансляции одного кодона - 0,046 секунды. Учитывая это значение, можно даже предполагать, что наименьший период трансляции кодонов - периодичность поступления остатков в цитоплазму, не быстрее 0,01 с/остаток (т.е., меньше наименьшего наблюдаемого периода почти в пять раз). Справедливость нашего предположения обоснована (Basharov,2003). Можно посмотреть и цитированные там литературу, где обсуждается взаимосвязь скорости и надежности трансляции м-РНК на рибосоме, а также принимать во внимание данные о том, что в водной среде максимальная скорость питаемого нуклеозид-трифосфатом клеточного мотора не быстрее 102/сек (Vale,1996, JCellBiol:135,291; Kinosita et al,1998,Cell:93,21).


Далее сосредоточимся на данных о временах сворачивания белков и белковых фрагментов. Хорошо известно, что характеристические времена конформационных изменений молекул составляет 10-12 - 10-7с, α-спирали и β-листы в полипептидах формируются за 10-7 - 10-4с (Eigen,1968,ChimPhys:65,53), а компактные состояния за 10-5 – 10-2с (Eaton et al,1997,CurrOpinStrBiol:7,10). Сворачивание малых однодоменных белков, как полагают, происходит 10-4 – 10-2с (Ptitsyn,1991,FEBS Lett,285,176; Sosnick etal,1997,PNAS:94,8545). Белки сворачиваются очень быстро также in vivo (Kolb et al, JBC:275,16597).

При сопоставлении представленных выше временных масштабов становится очевидным, что формирование вторичных структур и компактных состояний в полипептидной цепи происходит быстрее изменения ее химической структуры на один аминокислотный остаток при биосинтезе. Даже сама нативная конформация белка может формироваться быстрее по сравнению с самым коротким периодом элонгации полипептидной цепи на один остаток на рибосоме. Поэтому, пока очередной любой остаток присоединяется к полипептидной цепи в пептидилтрансферазном центре, в выступающем из рибосомы N-концевом сегменте цепи могут формироваться и α-спирали, и β-листы, и компактные состояния, и какая-нибудь определенная пространственная структура самого сегмента. Именно этот простой и очевидный вывод, по нашему мнению, является надежным обоснованием того, почему белки должны сворачиваться в процессе биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме – котрансляционно.

Примерный механизм сворачивания белков: котрансляционное постепенное формирование нативной конформации. Как было отмечено выше: а) аминокислотные остатки синтезируемой полипептидной цепи поступают из рибосомы в цитоплазму для сворачивания с N-концевого, последовательно друг за другом и постепенно с периодичностью не быстрее 0,01с; б) времена сворачивания белковых фрагментов и белков меньше этого времени. Опираясь лишь на эти данные, и учитывая наблюдения, о том, что рибосома и синтезируемая полипептидная цепь не образуют ассоциаты ни при синтезе цепи и ни после его завершения, можно сформулировать следующую простую и вполне очевидную примерную схему процесса сворачивания белка в непосредственной близости рибосомы.


- Сворачивание белка начинается с момента выхода первого N-концевого аминокислотного остатка полипептидной цепи из рибосомы в цитоплазму, продолжается во время трансляции цепи и завершается после выхода из рибосомы C-концевого последнего остатка.

- Сворачивание белка происходит последовательными этапами, по мере транслокации остатков цепи из рибосомы. На каждом этапе формируется определенная структура N-концевого сегмента цепи, выступающего из рибосомы, причем вторичная и третичная структуры сегмента формируются одновременно и вместе. Число и последовательность этапов процесса аналогичны тем, что и событий трансляции при биосинтезе цепи.

- Элементы вторичной структуры (α-спирали, β-листы, повороты), сформированные на каждом этапе, могут разрушаться, изменяться или оставаться неизменными на следующем этапе, после удлинения сегмента на очередной аминокислотный остаток.

- На всех этапах процесса, формирование структуры N-концевой части цепи, а также на последнем этапе – нативной структуры белка, происходит не дольше 0,01с. Общее время процесса сворачивания белка имеет такой же порядок, что и суммарное время синтеза цепи на рибосоме.

Предлагаемая нами модель схематически представлена в левой части рис.1, на примере полностью α−спирального белка апомиоглобина, где зафиксированы четыре стадии сворачивания синтезируемого на рибосоме полипептида во времени. Отметим, что при формулировке модели мы полагали, что область поверхности рибосомы, возле которой полипептидная цепь сворачивается, составлена из полярных аминокислотных остатков и сильно гидратирована. Предположение поддерживается данными о кристаллической структуре рибосомы и наблюдениями о том, что рибосома и синтезируемая полипептидная цепь не образуют ассоциаты во время синтеза цепи до его завершения. Гидратный слой, по-видимому, экранирует (явление, скорее, сильно выраженное в клеточной биологии), синтезируемую и сворачивающуюся цепь от взаимодействия с рибосомой.


Анализ известных моделей о возможном механизме сворачивания белков. В данном параграфе диссертации представлен анализ известных моделей о возможном механизме котрансляционного сворачивания белков и указаны их недостатки. Результаты анализа опубликованы (Башаров 2000б).


Глава 11. Сворачивание белка в компартментах клетки отдаленных от рибосомы. Полипептидные цепи многих белков транслируются в отдаленные от рибосомы различные водные компартменты клеток и сворачиваются там. Ими являются в прокариотических клетках периплазма, а в клетках эукариот, в частности, - матрикс и межмембранное пространство митохондрий, строма, межмембранное пространство и тилакоидный люмен хлоропласт, люмен эндоплазматического ретикулуума (ЭР), матрикс пероксисом. Для того, чтобы выяснить процесс сворачивания белков в этом случае, проследим, как и в случае сворачивания белка около рибосомы, судьбу белковых цепей в компартменте, с момента поступления туда и до завершения сворачивания, учитывая при этом механизм, способ и скорость импорта цепи, возможные изменения, которые может она претерпевать, а также силы обуславливающие сворачивание и времена сворачивания белков и белковых фрагментов.

Полипептидные цепи предшественников белков пересекают одну или несколько мембран, чтобы попасть в компартменты сворачивания. (Пути транспорта определяет расположенный впереди N- конца цепи прекурсор, состоящий из одного или нескольких расщепляемых сигнальных пептидов.) Цепи поступают в компартмент через узкий гидрофильный белковый канал в мембране диаметром 20 - 26Å. Канал является частью системы импорта белков, транслокона. Все транслоконы сильно похожи (рис.7). Они состоят из нескольких мембрано-встроенных, -причаленных или -ассоциированных гетероолигомерных белков, которые формируют четыре функционально разные системы: узнавания и причаливания сигнального пептида, проводящий белок узкий гидрофильный трансмембранный канал, узнавания и процессинга сигнальной последовательности, транслокационный мотор.


Транслокация полипептидных цепей в различные компартменты сворачивания происходит по одинаковому механизму. Предшественники полипептиды импортируются в компартменты в развернутом виде N–концом (рис.7). Сигнальный пептид отщепляется сигнальной пептидазой котранслокационно, как только N–конец цепи поступает в компартмент. Любая другая реакция процессинга полипептидной цепи в компартменте происходит котранслокационно также (напр., гликозилирование остатков Asn в люмене ЭР). Импорт полипептидов в компартмент осуществляется посредством транслокационного мотора, за счет энергии АТФ или ГТФ.







Рис.7. Система и механизм импорта полипептидов в митохондрии (а) и хлоропласты (б) (Haucke&Schatz,1997,TICB,7,103), бактерии (E.coli) и эукариот (S.cerevisiae) (Pohlschroder et al,1997,Cell,91,563). Импорт белков из цитоплазмы осуществляется транслоконом внешней (OM) и внутренней (IM) мембран митохондрий (Tom, Tim) и хлоропласта (Oep/lap, Iep/lap). По мере синтеза пробелки могут ассоциировать в цитоплазме с шаперонами (Hsp70, MSF), которые доставляют их к рецепторным белкам на внешней мембране. SRP– сигнал-узнающая частица. SecYEG и Sec61 формируют проводящий белок канал в мембране. Hsp70,mHsp70,sHsp100,SecA,Kar2 - транслокационные моторы.

Итак, согласно известным данным молекулярной клеточной биологии, изложенным выше вкратце, транслокация полипептидных цепей белков в отдаленные от рибосомы компартменты клетки происходит определенным, одинаковым как из рибосомы, образом. Цепи поступают в эти компартменты N-концом в развернутом виде из узкого белкового канала в мембране, как из канала рибосомы в цитоплазму (рис.8).


Выясним теперь скорость транслокации полипептидных цепей через мембрану в компартменты, которая почти не исследована. Представляется разумным, если предположим, что транслокация цепей через мембраны осуществляется при скоростях не быстрее высокой скорости элонгации полипептидной цепи на рибосоме, т.е. с периодичностью 0,01 с/остаток (см. предыдущий §). Предположение справедливо в случае котрансляционной транслокации полипептидной цепи в люмен ЭР, по меньшей мере, т.е. когда рибосома причалена к мембране ЭР и непосредственно синтезирует цепь прямо в люмен через транслокационный канал мембраны (рис.8б).




Рис.8.Полипептидные цепи поступают в различные компартменты из узкого канала рибосомы (а) или транслокона в мембране (b, с) и сворачиваются там во время транслокации, ко- (а, b), или посттрансляционно (с) (Basharov,2003).


Предположение поддерживается оценочными экспериментальными данными: от 20 до 30 остатков переходит через мембрану E.coli в периплазму за время от нескольких сек. до одной мин. (Economou etal,1995,Cell: 83,1171), максимальный период транслокации цепи через внутреннюю мембрану митохондрий посредством транслокона ~0,7 с/остаток (Schwartz & Matouschek, 1999,PNAS:96,13086). Предположение оправдано, если учесть уже упомянутые данные о том, что в водной среде максимальная скорость клеточного мотора не быстрее 102/сек, и тем, что рибосома и транслоконы обладают общими структурно-функциональными особенностями в части выполнения транслокационных функций. Рибосома сама является транслокационной машиной и состоит из тех же функциональных элементов, что и транслоконы, за исключением системы процессинга сигнального пептида.

Вышеизложенное обсуждение можно резюмировать так. Для сворачивания, импорт аминокислотных остатков полипептидных цепей из транслоконов в мембране в отдаленные от рибосомы компартменты и из рибосомы в цитоплазму происходит одинаковым образом: направленно N- концевым, последовательно и постепенно с периодичностью не быстрее 0,01секунды. Таким образом, сворачивание белка в отдаленных от рибосомы водных компартментах также может произойти согласно предложенной выше схеме сворачивания белка возле рибосомы, с единственной разницей, что термин «рибосома» следует заменить на «транслокон».



Глава 12. Поддерживающие предлагаемый механизм сворачивания белков данные. Здесь мы приводим ряд известных экспериментальных данных и некоторые результаты наших расчетов, которые, по нашему мнению, поддерживают предложенную нами модель сворачивания белков.

Основу предлагаемой модели составляет три важных положения. Первое: субстратный полипептид не образует ассоциат с рибосомой при биосинтезе и транслоконом при транслокации через мембраны, а также при сворачивании, т.е., транслокационный комплекс или рибосома в сворачивании белка не участвует. Второе: за время поступления каждого очередного аминокислотного остатка в компартмент (не меньше 0,01с), формируется определенная структура N-концевого сегмента цепи, находящегося в компартменте. И третье: сформированная на каждом этапе структура динамична – она может измениться с изменением химической структуры цепи по мере постепенного роста. Все три положения достаточно очевидны.

Первое положение экспериментальный факт, установленный клеточными биологами (Nissen etal,2000,Science:289,920; Kramer etal,2001,IntJBioch&CellBiol, 33,541). В этой связи мы обращаем особое внимание на экранирующую роль гидратного слоя вблизи полярной белковой поверхности, около которой сворачивается белок. Второе положение хорошо известные данные о временах формирования вторичных и компактных структур в полипептидной цепи. Оно подтверждается также результатами экспериментов in vivo, согласно которым белки проявляют активность сразу после выхода из рибосомы, или даже пока продолжается синтез полипептидной цепи.

Что касается третьего положения о динамическом изменении конформации цепи по мере ее удлинения в каждом цикле элонгации, оно, прежде всего, очевидно из природы физических сил, вызывающих сворачивание белков. Изменение химической структуры полипептидной цепи при ее росте по одному аминокислотному остатку, обуславливает дополнительные взаимодействия нового остатка с остальными и молекулами среды. Подтверждающие это положение некоторые данные приведены ниже.


Динамичность конформации в зависимости от длины полипептидной цепи. Экспериментальная поддержка модели. Конформационный анализ десяти различной длины фрагментов полипептидной цепи химотрипсинового ингибитора (ХИ2; 64 остатков) проведен методами КД, ЯМР и др. (Prat Gay et al,1995a,JMolBiol.254,968; 1995b,PNAS,92,3683). Нативная структура ХИ2 составлена из одной α-спирали (остатки 12-24), шести β−листов (3-5, 8-11, 28-34, 45-51, 55-58, 60-64) и четырех β−поворотов (5-8, 25-28, 35-42, 52-54). Фрагменты состояли из 5 (ХИ2-5), 13 (ХИ2-13), 25 (ХИ2-25), 28 (ХИ2-28), 40 (ХИ2-40), 50 (ХИ2-50), 53 (ХИ2-53), 60 (ХИ2-60), 62 (ХИ2-62) и 63 (ХИ2-63) N-концевых остатков. Пептиды ХИ2-5 и ХИ2-13 проявляют признаки β−поворота, тогда как в нативном белке остатки 1-13 образуют два β−листа и один поворот. Пептиды ХИ2-25 и ХИ2-28 неупорядоченно компактны, тогда как в нативном ХИ2 остатки 12 – 24 образуют стабильную α-спираль. Пептид ХИ2-40 обладает компактной структурой с гидрофобным кластером, а ХИ2-49 компактнее, но нативнооподобные взаимодействия в них отсутствуют. Фрагмент ХИ2-53 обладает хорошо сформированным мини ядром, а ХИ2-60 свернут сильнее и более компактен. В формировании нативноподобной структуры ХИ2 определяющую роль играют пять С-концевых остатков. Эти результаты свидетельствуют о том, что пространственная структура цепи ХИ2 при ее постепенном удлинении динамична – вторичная и третичная структуры полипептида постепенно меняются по мере его роста.

В исследованиях зависимости структуры семи фрагментов барназы от длины биофизическими методами установлено, что вторичная и третичная структуры фрагментов формируются вместе и динамичны: компактность неуклонно растет в фрагментах с длиной от 22 до 68 остатков по мере удлинения цепи, потом резко падает в фрагменте с длиной 79 остатков, а затем снова растет (Neira&Fersht,1999, JMolBiol:287,421).

Результаты исследований зависимости структуры N-концевых фрагментов апомиоглобина с длиной 36, 77 и 119 остатков представлены на рис.9, где также приведены известные схемы сворачивания этого белка.





Рис.9. Схемы сворачивания апо-Мб. а-ренатурация из денатурирован-ного состояния (Jennings&Wright, 1993,Sci:262,892;ЯМР); b- гипотети-ческий механизм на основе посттр-ансляционного подхода: цепь имеет вид случайного клубка пока не синтезирована полностью; c-другой гипотетический механизм: вторич-ная структура формируется по мере синтеза соответствующего сегмента цепи; d- механизм, предложенный на основе ЯМР исследований (Chow et al., 2003).






Основной вывод этих исследований такой же, как и в случае с белком ХИ-2: вторичная и третичная структуры динамичны и значительно меняются с удлинением цепи. Содержание элементов вторичной структуры исследованных фрагментов и нативного апомиоглобина приведены в табл.8. Сравнивая данные соответствующих столбцов панелей а и d рис.9 и табл.8 можно убедиться и в том, что пути формирования пространственной структуры апомиоглобина из денатурированного мочевиной состояния и при постепенном росте его полипептидной цепи отличаются кардинально.


Таблица 8. Содержание элементов вторичной структуры в апомиоглобине (апо-Мб) и его фрагментах

Фрагмент апо-Мб

Содержание элементов (в долях)

α

β


β + t

rc

(1 – 36) апо-Мб

0.04

0.40

0.62

0.34

(1 – 77) апо-Мб

0.16

0.29

0.51

0.33

(1 – 119) апо-Мб

0.30

0.18

0.40

0.30

(1 – 153) апо-Мб (нативный)

0.50

0.04

0.28

0.21

Примечание. Символы α, β, β+t и rc соответственно обозначают: α−спирали, β−листы, β−листы плюс β−повороты, неупорядоченные структуры (random coil).

Зависимость стабильности спиральных конформаций олигопептидов от длины цепи. Динамическое изменение конформации полипептидной цепи в зависимости от ее длины следует из наших расчетов ППЭ олигопептидов глицина и аланина методом ФФВ. В качестве примера в табл.9 приведены относительные энергии двух конформеров последовательных олигопептидов этих аминокислот. Конформеры соответствуют популярным конформациям: полностью вытянутой С5 (φ=180o, ψ=180o) которая, как считают, наиболее удобно представляет конформацию статистического клубка, и α-спиральной (φ=-60o, ψ=-40o).



Таблица 9. Относительные энергии двух конформаций олигопептидов глицина и аланина с длиной от двух до десяти остатков (в ккал/моль)

n-

пептид

Gly

Ala

С5(φ=180o,ψ=180o)

α(φ=-60o,ψ=-40o)

С5(φ=180o,ψ=180o)

α(φ=-60o,ψ=-40o)

ΔЕ пол.

ΔЕ кул.

ΔЕ пол.

ΔЕ кул.

ΔЕ пол.

ΔЕ кул.

ΔЕ пол.

ΔЕ кул.

2

0,8

0,8

6,7

6,4

3,9

0,0

6,7

6,4

3

0,6

0,6

5,2

5,2

3,8

0,4

5,7

5,1

4


0,7

0,6

3,8

4,0

3,8

0,4

4,1

4,0

5

0,6

0,6

2,9

3,4

3,8

0,3

3,1

3,1

6

0,6

0,6

2,3

2,9

3,8

0,3

3,1

3,3

7

0,6

0,6

1,8

2,3

3,8

0,3

2,4

2,7

8

0,6

0,6

1,4

2,0

3,8

0,3

1,4

2,0

9

0,6

0,6

1,1

1,7

3,8

0,3


1,1

1,8

10

0,6

0,6

0,9

1,5

3,8

0,3

0,9

1,6


В таблице приведены также величины кулоновского вклада в общую потенциальную энергию. Из представленных в табл.9 данных следует, что в олигопептидах аланина от дипептида до пентапептида предпочтительной является полностью вытянутая С5 конформация, а начиная с пентапептида предпочтительной становится α-спиральная. В дипептиде глицина α-спиральная конформация невыраженная, энергия ее стабилизации растет с увеличением числа остатков, с 6,7 ккал/моль в дипептиде до 0,6 ккал/моль в декапептиде, и судя по тенденции, она становится предпочтительной начиная с одиннадцати пептида.



<< предыдущая страница   следующая страница >>