litceysel.ru
добавить свой файл
1
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова



Факультет биоинженерии и биоинформатики


Проверка обоснованности гипотезы 'Ecdysozoa' на основании филогенетических деревьев рибосомных белков


Курсовая работа


студента 1 курса


И. А. Оловникова


Научный руководитель:

ведущий научный сотрудник

НИИ физ.-хим. биологии

им. А.Н. Белозерского, МГУ

к.б.н. В.В. Алёшин


Аннотация

В работе исследуется обоснованность кластирования линяющих животных (Arthropoda, Nematoda и др.), полученного по результатам анализа рибосомальной РНК. В качестве сравнивнительного объекта взяты рибосомальные белки, обладающие высокой консервативностью. Деревья, построенные разными методами для выровненных последовательностей отдельных белков, также как и деревья, построенные по объединенным последовательностям, не показали монофилетичности Ecdysozoa. На результате, вероятно, сильно сказывается скудность сегодняшних баз в отношении избранного маркера.

1. Введение

За несколько столетий существования сравнительной анатомии и морфологии животных, в том числе беспозвоночных, накоплено огромное количество данных, на основании которых построены филогенетические деревья, отражающие возможные пути эволюции организмов от бактерии до человека. Часто некоторые группы объединялись не совсем обоснованно, чему способствовали многочисленные параллелизмы, встречающиеся в морфологии животных, а также чрезвычайное многообразие жизненных форм в пределах одного истинного таксона. Таким образом, сравнительная анатомия и морфология (а часто и физиология), представив ту модель эволюции, которую мы видим сегодня в учебниках, как представляется, исчерпала свои возможности по установлению реального родства организмов. На помощь приходит молекулярная филогения, позволяющая избежать субъективного фактора, строить деревья видов, основанные на последовательностях тех или иных биологических полимеров, взятых из исследуемых организмов. Естественно, возникает вопрос о том, каким образом, имея такие последовательности , построить филогенетическое древо. К сожалению, эта проблема не разрешена и по сей день. Для исследования ранней дивергенции используют те молекулы, которые меньше других подвергаются быстрым эволюционным изменениям (то есть наиболее консервативные молекулы). Консервативны они потому, что несут жизненно важные функции; малейшее изменение в структуре молекулы может повести за собой необратимые последствия, и организм с этой дефектной молекулой погибнет. Но природа допускает небольшой люфт даже при построении таких молекул: все-таки возможны постепенные изменения их последовательностей с появлением компенсаторных изменений в других молекулах (или, как это ни странно, той же самой молекуле). Благодаря такому люфту мы и можем проследить эволюционный ряд: если в каком-то организме появилось изменение, которое присутствует у всех его потомков (синапоморфия), мы можем это явление изобразить на кладограмме узлом. В дальнейшем вновь может произойти какое-то небольшое изменение в одной из двух образовавшихся ветвей, и его мы опять же отметим узлом и т. д.

Одной из первых и самых перспективных исследуемых консервативных молекул стала рибосомальная РНК (рРНК), образующая «скелет» рибосомы [Pechman, Woese 1972]. С помощью нее были построены новые деревья видов, которые во многом сильно отличались от «классических» деревьев. Одной из недавних сенсаций, сделанных на основе сравнения последовательностей рибосомальной РНК беспозвоночных животных, стало обнаружение существенного сходства этой рРНК у таких разных групп как круглые черви, членистоногие, тихоходки, приапулиды и др. [Aguinaldo et al. 1997]. Интересно, что всех их объединяет линька, и поэтому объединенный таксон (неясного ранга) назвали ”Ecdysozoa”, т.е. ”линяющие животные” (молекулярная филогения здесь непосредственно граничит с морфолого-анатомической!). Это открытие повлекло за собой большой поток исследовательских работ. Одни данные подтверждают родство этих групп [Crossgrove K et al. 2002 ; Haase A et al. 2001 и др.], другие, наоборот, опровергают его, указывая на искусственность филогенетического метода, применяемого авторами гипотезы [см.напр. Jaime E. Blair et al. 2002]. На самом деле, действительно, существуют некоторые не молекулярно-филогенетические предпосылки к объединению линяющих групп. Например, давно уже показано, что линяющие животные лишены эктодермальной цилиатуры. В то же время планктотрофные личинки представителей группы Lophotrochozoa, противопоставляемой теперь Ecdysozoa, имеют мерцательную выстилку кишечника, с помощью которой они прогоняют сквозь себя воду с пищей; у личинок же Ecdysozoa планктотрофные личинки на ранних стадиях онтогенеза приобретают конечности, которые выполняют аналогичную функцию. Также в некоторых физиологических экспериментах (см.напр. Crossgrove K et al. 2002) показано, что введение гормонов, участвующих в подготовке к линьке, самой линьке или определенных стадиях метаморфоза насекомого, могут индуцировать сбрасывание ларвальных покровов нематоды. Существуют, однако, немертины. Их планктонная личинка (пилидий), обильно покрытая ресничками, к конечной стадии развития сбрасывает покровы, из которых выходит молодое животное. Линька пилидиев, возможно, и не имеет общего с линькой Ecdysozoa, зато показывает, какое поразительное сходство может возникнуть в результате конвергенции, и заставляет задуматься о справедливости принятых многими авторами по умолчанию гипотезах, таких, как например, гипотеза Deuterostomia-Lophotrochozoa-Ecdysozoa.


В настоящей работе поставлена задача предварительного исследования этого феномена с помощью других молекул, а именно рибосомальных белков [Wolf et al. 2001]. Они выбраны потому, что несмотря на непосредственное взаимодействие с рРНК, они эволюционируют в большой степени независимо от нее, и это позволит проверить полученный ранее неожиданный результат с помощью абсолютно иного и нового филогенетического маркера. Многие из этих белков (а их известно несколько десятков) соответствуют всем устоявшимся на сегодняшний день представлениям о консервативности и постепенной нейтральной или прогрессивной эволюции. Задача работы состоит в отборе белков с наибольшей таксономической представленностью в доступных сегодня базах данных, их выравнивании и построении максимально реалистичных (математически) деревьев.

2. Материалы и методы

2.1. Электронные базы данных и поиск по ним

Для поиска первичных структур рибосомальных белков использовались ресурсы “Entrez-protein” NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein ), The Institute of Genomic Research (http://tigrblast.tigr.org/euk-blast/index.cgi?project=sma1), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml ), базы данных по паразитическим организмам (http://www.ebi.ac.uk/blast2/parasites.html), EBI Sequence Retrieval System ( http://srs.ebi.ac.uk/ ), Nematode Net (http://www.nematode.net/ ), BlaxterLab Nematode Blast Server (http://nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html) и некоторые другие. Поиск проводили по ключевым словам, а в тех базах, где предусмотрен поиск по первичным структурам макромолекул, использовали программу BLAST [Altschul et al., 1997] или WU-BLAST [Gish, States, 1993].



2.2. Анализ кДНК


Для некоторых белков, отсутствующих в базах белковых последовательностей, использовали базы кДНК. Найденные нуклеотидные последовательности транслировали программой ExPASy Translation tool(http://us.expasy.org/tools/dna.html), а нужную рамку трансляции отбирали с помощью программы DotHelix пакета EMBOSS (http://www.belozersky.msu.ru/services/ dhm/advanced.html ), которая строит карту локального сходства двух последовательностей. Суммарные последовательности некоторых рибосомных белков были составлены по последователь- ностям нескольких клонов кДНК, извлеченных из соответствующих баз.


2.3. Форматы записи


Отобранные последовательности переводили в FASTA формат и сохраняли в соответствующем файле. Для каждого белка был создан отдельный файл, каждая запись в котором содержит ID последовательности в одной из указанных баз, название организма и саму последовательность. Также для удобства работы с программой визуализации деревьев каждый файл был сохранен еще и без ID записей (которые сильно загромождают рисунок при выводе построенного дерева).


2.4. Выравнивание последовательностей

С помощью программы ClustalW 1.83 (Thompson et el., 1994) отобранные последовательности были выровнены, и построены предварительные деревья (все параметры принима- лись по умолчанию). Файл с выравниванием ( расши- рение “.aln”) переводил ся в формат PHYLIP программой FORCON (Raes, J. and Van de Peer,Y. (1999),