litceysel.ru
добавить свой файл
1
Петрозаводский государственный университет


Эколого-биологический факультет

Кафедра молекулярной биологии, биологической и органической химии


Реферат

Тема: Внеклеточный синтез белка


Выполнила:

студентка гр.31501 Н.В. Лесонен

Преподаватель:

Л.В Топчиева


Петрозаводск, 2010

Изолированные клеточные органеллы (хлоропласты, митохондрии, микросомы, лизосомы, пероксисомы и др.) как объекты биотехнологии содержат ферменты или полиферментные комплексы и в то же время свободны от большинства других компонентов клетки. Выделение органеллы или группы органелл обычно представляет собой более простую процедуру, чем получение очищенного фермента. В отличие от клеток, изолированные органеллы не растут и не делятся.

Бесклеточные белоксинтезирующие системы: общие сведения

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы.

Преимуществом бесклеточных систем перед клетками является доступность их компонентов для экспериментальных воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных экзогенных факторов на их функционирование (ионные условия, рН, ингибиторы и активаторы и т.п). В бесклеточной системе можно заменять отдельные компоненты или непосредственно воздействовать на них в изолированном состоянии и затем по реакции системы познавать их функциональную значимость. Большинство результатов, полученных с помощью бесклеточных систем, невозможно было бы получить при использовании живых клеток, погибающих при нарушении гомеостаза. Достоинства бесклеточных систем одновременно являются их слабым местом, поскольку после разрушения клеток исчезают многочисленные взаимодействия между их компонентами, благодаря которым можно отличить живую клетку от бесклеточного экстракта.

Бесклеточные белоксинтезирующие системы представляют собой одни из самых сложных и многокомпонентных систем in vitro, используемых в биохимии. Это связано с необходимостью воспроизведения в пробирке всех этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Тем не менее удается успешно осуществлять процесс биосинтеза белка in vitro и использовать такие системы по трем основным направлениям: для анализа кодирующего потенциала нуклеиновых кислот, исследования механизмов биосинтеза белка и препаративной наработки некоторых рекомбинантных белков и пептидов.


По природе компонентов, которые определяют способность бесклеточных систем осуществлять трансляцию определенных мРНК, принято различать прокариотические и эукариотические системы. Наиболее эффективная трансляция мРНК происходит в гомологичных бесклеточных системах. Под контролем гомологичных регуляторных элементов в бесклеточных системах могут быть успешно транслированы и чужеродные мРНК - транскрипты рекомбинантных генов.

В некоторых бесклеточных системах транслируют предварительно очищенную мРНК или используют эндогенную мРНК, присутствующую в полисомах. В других белоксинтезирующих системах - системах сопряженной транскрипции и трансляции, одновременно происходят синтез мРНК и ее трансляция рибосомами.

Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Разработаны проточные белоксинтезирующие системы, в которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время, непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов системы.

Прокариотические системы синтеза белка

Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli. Прокариотическая, как и любая другая бесклеточная система биосинтеза белка, должна содержать несколько обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2) матричный полирибонуклеотид (мРНК или синтетические полинуклеотиды); 3) аминоацилированные тРНК; 4) GTP в качестве источника энергии; 5) одновалентные (К+ или NH4+) и двухвалентные (Mg2+ или Са2+) катионы, а также буферные вещества для поддержания рН системы в физиологических пределах.


Одним из наиболее важных условий функционирования бесклеточных систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. Ученые в наше время научились выделять рибосомы, активные на 80-100 % , добились скорости роста белковой цепи in vitro, сравнимой с той, что имеет место в живой бактериальной клетке. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще всего используют экстракты соответствующих клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде, суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат центрифугируют при 30 000 g. При этом в супернатанте (так называемом SЗО-экстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся бактериальные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.

Если разрушение бактериальных клеток проводят жесткими методами с применением ультразвука, растирания со стеклянными бусами и т.п., освобождение от эндогенных нуклеиновых кислот становится сложной задачей и требует фракционирования экстрактов с помощью ионообменной хроматографии. При хроматографической очистке фракции S1OO из нее удаляются все аминоацилированные и свободные молекулы тРНК. Поэтому при реконструировании бесклеточной белоксинтезирующей системы к объединенным фракциям рибосом и S1OO-экстракта добавляют препарат очищенной суммарной тРНК.

Экстракты бактериальных клеток S30 и S1OO, кроме всех необходимых факторов трансляции, содержат и основные компоненты системы транскрипции, включая РНК-полимеразу, фактор терминации транскрипции p, CRP-белок и т.п. Поэтому для создания ДНК-зависимой системы сопряженной транскрипции и трансляции, в которой происходит полная экспрессия генов, находящихся под контролем бактериальных регуляторных элементов не требуется введения в нее дополнительных белков. Достаточно внесения в систему экзогенной ДНК-матрицы, транскрибируемой бактериальной РНК-полимеразой, а также четырех рибонуклеозидтрифосфатов, чтобы начала активно синтезироваться мРНК и одновременно транслироваться рибосомами. В итоге удается синтезировать высокомолекулярные белки, обладающие ферментативной активностью.


Экстракты бактериальных клеток содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков in vitro, разрушая мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих затруднений в бесклеточных системах используют экстракты мутантных бактериальных клеток, дефектных по РНКазам и полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы при необходимости вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п.

Не существует больших ограничений на первичную структуру мРНК, транслируемых в бактериальных бесклеточных системах. Единственным необходимым условием их эффективной трансляции является отсутствие совершенной вторичной структуры или каких-либо особо прочных кооперативных спиральных участков. Вторичную структуру транслируемых мРНК обычно разрушают кратковременным прогреванием с последующим быстрым охлаждением непосредственно перед внесением ее в пробы. GTP относится к обязательным компонентам бесклеточной белоксинтезирующей системы. Он не может быть заменен на любой другой из известных рибонуклеозидтрифосфатов и необходим для мРНК-зависимого связывания аминоацил-тРНК с рибосомами и транслокации. Поскольку при трансляции происходит непрерывное расходование GTP, а образующийся при этом GDP является ингибитором трансляции, в процессе функционирования бесклеточной системы осуществляют постоянную регенерацию GTP. Для этого применяют АТР в качестве донора фосфатных групп, которая регенерируется путем переноса фосфатной группы вводимого в бесклеточную систему фосфоэнолпирувата с помощью пируватфосфокиназы. Энергия макроэргических связей АТР используется также при аминоацилировании тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами. В том случае, если создается бесклеточная система сопряженной транскрипции и трансляции, для осуществления синтеза РНК в нее вводятся еще два недостающих рибонуклеозидтрифосфата: UTP и СТР.

Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия, особенно концентрацию ионов Mg2+. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg2+ в системе на 1-2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. Влияние ионов Mg2+ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, по-видимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+. В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са2+ и даже Мn2+, а также частично замещены полиаминами: спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков.


Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов K+ или NH4+, оптимальные концентрации которых составляют около 100 мМ. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов Сl-. Ионы Mg2+, К+ и NH4+ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме.

Эукариотические системы синтеза белка


Среди бесклеточных систем биосинтеза белка, пригодных для непосредственной трансляции мРНК высших организмов, наиболее часто применяются белоксинтезирующие системы из ретикулоцитов кроликов, зародышей пшеницы и культивируемых соматических клеток различного происхождения. Системы всех трех типов могут быть использованы с одинаковым успехом для трансляции разнообразных мРНК и, как правило, не обнаруживают видоспецифичности. Основные принципы конструирования прокариотических белоксинтезирующих систем применяют и для получения систем биосинтеза белков высших организмов. Специфика последних связана, прежде всего, с биологическими особенностями объектов, которые служат источником белковых компонентов систем, а также с различиями механизмов биосинтеза белка у прокариот и эукариот.

Ретикулоциты - безъядерные предшественники эритроцитов человека и животных, осуществляют активный синтез гемоглобина и обладают всеми необходимыми компонентами белкового синтеза. Отсутствие ядер дает возможность получать бесклеточные экстракты, минимально загрязненные геномной ДНК. Эти особенности ретикулоцитов животных делают их излюбленным источником бесклеточных экстрактов, способных осуществлять эффективную трансляцию разнообразных экзогенных мРНК.

Особенности бесклеточной белоксинтезирующей системы из ретикулоцитов кроликов состоят в том, что, во-первых, для регенерации АТР в качестве доноров фосфатных групп используют креатинфосфат - универсальный аккумулятор энергии в макроэргических связях у большинства позвоночных, а сам перенос групп осуществляется вводимой в систему креатинфосфокиназой. Во-вторых, для предотвращения ингибирования трансляции в процессе синтеза белка в систему вводят гемин.


Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза белка. Различия заключаются главным образом в методах получения бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем перед другими являются возможность длительного хранения и доступность исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует проведения экспериментов с лабораторными животными.

Несмотря на то, что разные эукариотические бесклеточные белоксинтезирующие системы активно транслируют гетерологичные мРНК, гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно. Например, глобиновые мРНК используются в синтезе белка в 7-8 раз лучше лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников китайских хомячков. Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции определенных мРНК.

Проточные системы синтеза белка

Впервые эффективную бесклеточную белоксинтезирующую систему удалось получить в лаборатории А.С. Спирина в 1988 г. В их модификации бесклеточные экстракты бактериальных или эукариотических клеток помещают в ячейку, закрытую с двух сторон полупроницаемыми мембранами. Размер пор позволяет проходить через мембраны вместе с током жидкости низкомолекулярным химическим веществам и небольшим белкам. Ячейку с компонентами для бесклеточной трансляции инкубируют при обычной температуре. С одной стороны в ячейку-реактор со скоростью примерно 1 мл/ч непрерывно поступают ингредиенты, расходуемые в процессе биосинтеза белка (аминокислоты, АТР, GTP), с другой стороны выходят синтезированные белковые продукты (если их молекулярная масса и отсутствие способности к агрегации позволяют пройти через поры мембраны).


Биосинтез белка в проточной системе может продолжаться непрерывно в течение нескольких десятков часов, причем на одну молекулу транслируемой мРНК синтезируются сотни копий полипептидных цепей белков, суммарный выход которых может достигать 200 мкг и более на 1 мл бесклеточного экстракта.

С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирующей системы стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной деградации протеиназами или образующие тельца включения в живых клетках. Проточная система может быть полезна для получения белков, обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных полипептидов, для которых нежелательны артефактные посттрансляционные модификации, происходящие in vivo. В таких системах удалось получить препаративные количества функционально активного интерлейкина 6 человека.


Иммобилизация – прикрепление вещества в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембрану.

Иммобилизированные рибосомы используют для углубленного изучения различных стадий трансляции, белкового фолдинга, скорости биосинтеза белка. Существуют различные способы иммобилизации. В частности, в экспериментах (Uemura et al, 2008), рибосомы иммобилизуют на стеклянной поверхности, добавляют коммерческие смеси, содержащие очищенные факторы и ферменты необходимые для трансляции. Рибосомные субъединицы помечают с помощью флюоресцентного красителя – цианина 3 и по появлению зеленой флуоресценции оценивают синтеза белка. Данный метод позволяет вскрыть механизмы динамичного взаимодействия м/д процессами трансляции белка и фолдинга.


Список литературы

  1. Uemura S. Single-molecule imaging of full protein synthesis by immobilized ribosomes / S. Uemura, R. Iizuka, T. Ueno, Y. Shimizu, H. Taguchi, T. Ueda, J. Puglisi, T. Funatsu // Nucleic Acids Res.- 2008.- Vol. 36(12)

  2. http://lib.e-science.ru/book/119/page/11.html

  3. http://humbio.ru/humbio/genexp/00033ac0.htm