litceysel.ru
добавить свой файл
1 2 3 4


На правах рукописи


ЧЕРКАЩЕНКО

Ольга Сергеевна



Токсиколого-гигиеническая характеристика триазавирина (натрия 7-метилтио-3-нитро-4-оксо-1,4-дигидро[1,2,4] триазоло[5,1-с] [1,2,4]триазин-1-ид дигидрата)



14.03.04 - токсикология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


Санкт-Петербург


2011 г


Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Северо-Западный научный центр гигиены и общественного здоровья» Роспотребнадзора


Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Луковникова Любовь Владимировна


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Ливанов Георгий Александрович

доктор медицинских наук,

профессор Глушков Сергей Иванович


Ведущая организация: ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России


Защита диссертации состоится «31» января 2012 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.030.01 при ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России (192019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, 1)


С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России


Автореферат разослан «27» декабря 2011 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Л.В. Луковникова


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Принятая Правительством РФ программа «Стратегия развития фармацевтической промышленности до 2020 года» в соответствии, с которой к 2020 году в России планируется синтезировать не менее 90 % препаратов, входящих в перечень жизненно необходимых лекарств, предусматривает интенсивное развитие отечественного фармацевтического производства. В этой связи большое значение приобретает оценка безопасности новых лекарственных препаратов, не наносящих ущерба здоровью человека и не обладающих опасными свойствами (Курляндский Б.А.; 2010, Гуськова Т.А., 2010; Верстакова О.Л., 2010).


Промышленный синтез лекарственных препаратов может представлять реальную угрозу загрязнения окружающей среды и оказывать значительный вред здоровью людей, профессионально занятых в сфере фармацевтической индустрии. В резолюции 3-го съезда токсикологов России (2009) подчеркивается, что «…прямым следствием неудовлетворительных условий труда является высокий уровень профессиональных заболеваний химической этиологии» (Курляндский Б.А., 2009). Оценка реальной опасности химических веществ, обоснование их минимально действующих, а также допустимых пределов риска с целью предупреждения неблагоприятного влияния на здоровье человека составляет основу профилактики острых и хронических профессиональных интоксикаций. Количественными критериями необходимыми для оценки риска здоровью персонала, контроля содержания химических веществ в воздухе рабочей зоны, обоснования применения средств индивидуальной защиты и организации основных профилактических мероприятий являются научно обоснованные гигиенические регламенты (ПДКр.з.., ОБУВ р.з.) химических веществ.

Среди множества синтезируемых лекарственных препаратов средствам, проявляющим противовирусную активность, уделяется особенно пристальное внимание. По данным научно-исследовательского института гриппа РАМН противовирусных средств лечения таких опасных инфекций, как желтая лихорадка и геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, особо опасные формы гриппа и атипичная коронавирусная пневмония до сих пор нет в мировой практике здравоохранения (Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита А.В., 2000; Деева Э.Г., 2008). Вследствие этого потребность в эффективных препаратах противовирусной терапии и химиопрофилактики чрезвычайно высока (Киселёв О.И., Маринич И.Г., Соминина А.А., 2003).

Анализ исторических и современных эпидемиологических данных показывает, что грипп остается непредсказуемой инфекцией, как с медицинской, так и социально-экономической точки зрения. Несмотря на успехи в создании противовирусных вакцин, ежегодно эпидемии гриппа охватывают многие страны и континенты. Прежде всего, это обусловлено антигенной новизной вирусов гриппа, их способностью к трансмиссии. Масштабы распространения эпидемий гриппа, высокая вирулентность вируса гриппа для человека стимулируют поиск новых эффективных средств противовирусной терапии и химиопрофилактики.


Триазавирин – оригинальный препарат синтезированный Институтом органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН.

Триазавирин представляет собой противовирусный лекарственный препарат, относящийся к группе индукторов интерферона. Предназначен для лечения гриппа (в том числе и птичьего), крымской геморрагической лихорадки, западного и восточного энцефаломиелита и других альфавирусных и буньявирусных инфекций.

Фармакологическая активность триазавирина достаточно хорошо изучена, однако данные о его токсичности и опасности при ингаляционном пути поступлении практически отсутствуют. В результате промышленного синтеза в воздух производственных помещений может поступать аэрозоль триазавирина и оказывать вредное действие на организм работающих. Внедрение современной технологии получения триазавирина требует исследования параметров токсичности и опасности названного противовирусного средства, особенно при ингаляционном пути поступлении, поэтому изучение токсических свойств и обоснование гигиенического регламента триазавирина для воздуха рабочей зоны является своевременным и актуальным.

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ФБУН «Северо-Западный научный центр гигиены и общественного здоровья» в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Гигиеническая безопасность России: проблемы и пути обеспечения на 2006-2010г.г.» по теме «Гигиеническая оценка факторов профессионального и экологического риска для населения и разработка мер по их снижению» (Номер государственной регистрации 01.2.00702346).

Цель настоящей работы – обосновать безопасный уровень воздействия триазавирина для здоровья работающих при его промышленном синтезе.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить параметры токсичности триазавирина на разных видах лабораторных животных при различных путях поступления;


2. Исследовать местное раздражающее, кожно-резорбтивное, аллергенное действие и способность триазавирина к кумуляции;

3. Оценить вероятность проявления мутагенного эффекта триазавирина;

4. Изучить влияние триазавирина на активность цитохром Р450 –зависимых МОГ при ингаляционном и парентеральном пути поступлении в организм;

5. Исследовать действие препарата на репродуктивную функцию;

6. Изучить влияние триазавирина на уровень восстановленного глутатиона, активность глутатионпероксидазы и К+, Na+-АТФ-азы при повторном введении;

7. Обосновать ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВр.з.) триазавирина для воздуха рабочей зоны.

Научная новизна. Получены новые данные о характере вредного действия противовирусного препарата триазавирина при различных путях поступления в организм: в желудок, в брюшную полость, при ингаляции аэрозоля препарата.

Установлено, что по параметрам острой токсичности триазавирин относится к малоопасным соединениям (ГОСТ 12.1.007-76).

Показано, что триазавирин не раздражает кожные покровы, слизистые глаз и верхних дыхательных путей, не проникает через неповрежденную кожу, не вызывает сенсибилизации организма экспериментальных животных, характеризуется как соединение со слабовыраженной степенью кумуляции.

В опытах in vivo на клетках костного мозга установлено, что триазавирин не оказывает мутагенного эффекта после однократного введения в брюшную полость мышам обоего пола дозы 500 мг/кг (близкой к DL16).

Триазавирин при введении в брюшную полость (1/3 DL50), а также при ингаляционном поступлении в организм экспериментальных животных приводит к ингибированию активности реакций гидроксилирования цитохром Р450-зависимых МОГ.

Способность триазавирина модифицировать активность цитохром Р450-зависимых МОГ при парентеральном и ингаляционном поступлении в организм можно использовать как биомаркер эффекта при оценке вредного действия.


Экспериментально показано, что триазавирин, вводимый ежедневно в течение 30 дней в брюшную полость белых крыс (доза 0,0135 мг/кг, сопоставимая с ОБУВ) не оказывает влияния на репродуктивную функцию и общее состояние экспериментальных животных.

При ингаляционном поступлении концентраций значительно превышающих пороговый уровень (Limac) и повторном введении возрастающих доз по методу Lim et al. установлено, что триазавирин приводит к снижению содержания гемоглобина в организме экспериментальных животных.

Полученные новые данные о токсичности и опасности триазавирина при различных путях поступления позволили обосновать величину гигиенического регламента (ОБУВ) для воздуха рабочей зоны.

Научно-практическая значимость. Результаты исследований позволили прогнозировать потенциальную опасность триазавирина для здоровья работающих в условиях производства данного препарата.

Выявленная способность триазавирина ингибировать активность цитохром Р450-зависимых МОГ позволяет прогнозировать характер комбинированного действия препарата с другими химическими веществами при их одновременном поступлении в организм.

Величина гигиенического регламента (ОБУВ) триазавирина для воздуха рабочей зоны и сформулированные гигиенические рекомендации являются основным практическим результатом реализации диссертационного исследования.

Разработаны предложения по проведению периодических медицинских осмотров лиц, контактирующих с исследуемым препаратом на производстве.

Положения, выносимые на защиту:


  • по параметрам острой токсичности триазавирин относится к малоопасным соединениям (4 класс опасности, ГОСТ 12.1.007-76), характеризуется слабыми кумулятивными свойствами, не раздражает кожу и слизистые, не вызывает сенсибилизации организма экспериментальных животных, не проникает через неповрежденную кожу, не оказывает мутагенного эффекта;

  • триазавирин, вводимый ежедневно в течение 30 дней в брюшную полость белых крыс на уровне ОБУВр.з. не оказывает влияния на репродуктивную функцию и общее состояние экспериментальных животных;


  • способность триазавирина ингибировать активность цитохром Р450-зависимых МОГ при различных путях поступления, можно использовать как биомаркер вредного действия при проведении экспериментальных исследований с целью обоснования гигиенического регламента;

  • величина гигиенического регламента (ОБУВ) триазавирина для воздуха рабочей зоны составляет 0,5 мг/м3.

Внедрение результатов исследования в практику. Материалы исследования использованы при создании нормативных и методических документов федерального уровня внедрения, необходимых для осуществления контроля содержания триазавирина в воздухе рабочей зоны предприятия. На основании выполненных экспериментальных исследований получены новые данные о токсичности и опасности триазавирина, которые позволили обосновать гигиенический регламент (ОБУВ) триазавирина для воздуха рабочей зоны на уровне 0,5 мг/м3 (Справка № 8/35-03-02/5-52 от 23.09.2010 Комиссии экспертов по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на XXXXI научной конференции - Хлопинские чтения «Внутрибольничная инфекция. Эпидемиолого-гигиенические и клинические проблемы» (Санкт-Петербург, 2008), на втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008), на научной конференции с международным участием «Медицина труда. Здоровье работающего населения: достижения и перспективы (актуальные вопросы профпатологии)» (Санкт-Петербург, 2009), на мемориальной научной конференции «Академик АМН СССР З.Г. Френкель. 140 лет со дня рождения» (Санкт-Петербург, 2009), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы промышленной токсикологии» (Москва, 2010), на юбилейной научной конференции «Химическая безопасность России: медицинские и эколого-гигиенические аспекты» (Волгоград, 2011), на заседании экспертов Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Москва, 10.04, 2009).


Личный вклад автора. Автором проведен сбор и анализ научной литературы по теме диссертации, составлен план и разработана программа экспериментальных исследований по изучению токсичности и опасности триазавирина. Автором организованы и проведены исследования по всем разделам работы, самостоятельно проведена статистическая обработка, анализ и обобщение полученных результатов, а также оформление внедрения результатов исследования в практику. Доля участия автора в накоплении информации - 90%, в обработке результатов исследования -100%.

Публикации: По материалам исследования опубликовано 13 научных работ, из них 3 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 140 с машинописного текста, состоит из введения, трёх глав, включающих: обзор научной литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований; заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Содержит 8 рисунков и 28 таблиц. Список литературы состоит из 245 источников, из них 182 отечественных и 63 иностранных авторов.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Материалы и методы исследования


Триазавирин (С5H7N6NaO5S) – натрия 7-метилтио-3-нитро-4-оксо-1,4-дигидро[1,2,4] триазоло[5,1-с] [1,2,4]триазин-1-ид дигидрат, М.м. 286,19, является синтетическим аналогом пуриновых нуклеозидов (гуанина) с выраженным противовирусным действием. По агрегатному состоянию представляет собой мелкокристаллический порошок или гранулы от светло-желтого до светло-коричневого цвета, горького вкуса, растворяется в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, ацетоне, плохо растворяется в воде, не растворяется в хлороформе. Основным механизмом действия триазавирина является ингибирование синтеза вирусных РНК и репликации геномных фрагментов (Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита А.В., 2000).

Экспериментальные исследования были выполнены на половозрелых беспородных белых мышах и крысах. Животные поступали из питомника «Рапполово» (РАМН) и содержались в виварии на стандартном рационе. Всего было использовано 450 крыс и 120 мышей. Общая схема исследований представлена на рисунке 1.


Определение параметров острой токсичности триазавирина проводилось на мышах с исходной массой 18-20 г и крысах массой 180 - 200 г. Исследуемое вещество вводили в желудок и брюшную полость в объёме 1 мл на 100 г массы тела крыс и 0,2 мл на 10 г массы тела мышей. Параметры острой токсичности рассчитывались методом пробит-анализа в модификации В.Б.Прозоровского (1962).

Определение пороговой концентрации однократного ингаляционного действия (Limac) аэрозоля триазавирина осуществляли при ингаляционной динамической подаче в специально сконструированных камерах для ингаляционных затравок мелких лабораторных животных (АС № 1183102 от 06.04.84) с применением специального дозатора, компрессора УК 40-2М, содержащего фильтр для очистки воздушного потока. Токсическое действие триазавирина при ингаляционном поступлении оценивали после 4-х часового воздействия концентраций 115, 62 и 5 мг/м3. У животных проводилось исследование основных функций и систем организма. Функциональное состояние центральной нервной системы изучали по способности к суммации подпороговых импульсов (СПП) по методу, предложенному В.В.Закусовым (1943, 1971, 1973), С.В.Сперанским (1965) и изменению поведенческих реакций по «норковому» рефлексу (Балынина Е.Г., Тимофеевская Л.А., 1978; Фролова А.Д. и соавт., 1980). Раздражающее действие на верхние отделы дыхательных путей оценивали по изменению частоты дыхания экспериментальных животных (Максимов Г.Г., 2006; Иванов Н.Г., 1973, 1978).

Мембранотоксическое действие исследовали по устойчивости мембран эритроцитов к гемолизу (Гительзон И.И., Терсков И.А., 1969), содержание восстановленного глутатиона по методу G.L. Ellman (1959). Функцию печени изучали по активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови методом Райтмана-Френкеля (Елисеев Ю.Ю., 2010). Функцию почек оценивали по величине суточного диуреза, содержанию белка (Михневич В.И., 1966), хлоридов в моче (Травина О.В., 1955) и титруемой кислотности мочи (Берхин Е.Б. и соавт, 1972).






Рисунок 1. Общая схема экспериментальных исследований триазавирина


В крови животных определяли содержание эритроцитов (Воробьёв А.И., 1969), лейкоцитов и гемоглобина (Кушаковский М.С., 1968).

Оценку местного раздражающего и кожно-резорбтивного действия триазавирина проводили на белых мышах и крысах в соответствии с МУ № 2802-79 и МУ № 2196-80. Реакцию кожи на действие препарата оценивали визуально после воздействия и далее ежедневно в течение 10 дней по изменению внешнего вида кожных покровов у подопытных животных по сравнению с контрольными. Если раздражающее действие не выявлялось после однократной аппликации, то нанесение препарата повторялось в течение 10 дней.

Изучение раздражающего действия на слизистые глаз осуществляли при внесении в конъюнктивальный мешок глаза крыс 25% мази препарата на вазелиновой основе, с последующей регистрацией видимых и скрытых повреждений роговицы в течение 3 суток. Скрытые повреждения роговицы выявляли с помощью 1% раствора флюоресцеина в 2% растворе NaHCO3.

Способность триазавирина проникать через неповрежденную кожу исследовали после однократных и повторных аппликаций, у животных регистрировали массу тела и поведение.

Исследование аллергенных свойств триазавирина проводили методом выявления гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах (МУ 1.578-96) при введении препарата в полном адьюванте Фрейнда (ПАФ).

Способность триазавирина к кумуляции оценивали по методу R.K. Lim et al (1961). Критерием оценки кумуляции служила гибель экспериментальных животных.

Изучение влияния триазавирина на репродуктивную функцию проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в пособии для врачей-токсикологов «Ускоренная оценка потенциальной опасности химических веществ для репродуктивной функции при их комплексном поступлении в организм животных» (2000).


Мутагенное действие триазавирина изучали методом микроядерного теста на мышах по K. Boller и W. Schmid (1970) и J. Heddle (1973). Микроядерный тест относится к скрининговым методам изучения мутагенного эффекта на клетках костного мозга in vivo и широко используется для выявления кластогенных химических соединений, способных вызывать структурные изменения хромосом.

Влияние триазавирина на активность цитохром Р450-зависимых МОГ оценивали косвенными методами: по времени окисления гексенала, характеризующему активность реакций гидроксилирования и по количеству выделенных метаболитов аминопирина с мочой. Нагрузка аминопирином позволяет последовательно оценить функциональную активность реакций гидроксилирования по выделению первого метаболита 4 аминоантипирина (4-ААП) и активность реакций ацетилирования по выделению второго метаболита ацетил-4-аминоантипирина (ацетил-4-ААП) (Арчаков А.И., 1975; Ляхович В.В., Цырлов И.Б., 1981; Леоненко О.Б., Попов Т.А., 1975).

Определение концентрации восстановленного глутатиона осуществляли с использованием 5,5’-дитио-бис(-2-нитробензойной кислоты) кислоты (ДТНБ) по методике G.L. Ellman (1959).

Активность глутатионпероксидазы определяли по методу А.Н. Гавриловой (1986) с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила (ГПТБ).

Определение активности К+, Na+-АТФ-азы в мембранах эритроцитов выполняли по методикам Д.Д. Семенчука (1981) и В.К. Рыбальченко (1988).

Все исследования были выполнены с соблюдением правил гуманного отношения к животным в соответствии с требованиями «Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, Женева, 1985).

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel». Полученные экспериментальные данные подвергались статистической обработке с применением параметрических (критерий Стъюдента-Фишера) и непараметрических (метод Вилкоксона-Манна-Уитни) методов статистики (Саноцкий И.В., 1970; Гублер Е.В., 1973).



Результаты исследований


В соответствии с целью работы были проведены исследования по выявлению критериев вредного действия триазавирина при моделировании однократного и повторного поступления препарата в организм экспериментальных животных.

Клиника острого отравления триазавирином характеризовалась адинамией, частым поверхностным дыханием, регистрацией бокового положения. При введении смертельных доз триазавирина в желудок и брюшную полость гибель животных наступала в течение 3-10 минут. Параметры острой токсичности триазавирина представлены в таблице 1. Как видно из таблицы при поступлении в желудок триазавирин характеризуется как малоопасное соединение (ГОСТ 12.1.007-76), в брюшную полость - как практически не токсичное вещество (5 класс токсичности) по классификации К.К.Сидорова (1973).


Таблица 1 - Параметры острой токсичности триазавирина


Вид

животных

Способ

введения

Доза, мг/кг

DL16

DL50

DL84

Мыши

в брюшную полость

876

1708 (1313,8÷2220,4)

2540

в желудок

4860

7620 (6195÷9373)

10380

Крысы

в брюшную полость

498

1353 (1048÷1745)


2211

в желудок




 10000





Исследования раздражающего действия показали, что триазавирин не оказывает раздражающего действия на кожу и не вызывает раздражения слизистых глаз, а также видимых и скрытых повреждений роговицы ни через 4 часа, ни через сутки после нанесения.

Оценка кожно-резорбтивного действия показала, что однократная и повторные аппликации триазавирина на кожу белых крыс не вызывали гибели животных, изменения массы тела и других симптомов интоксикации, что позволяет считать триазавирин препаратом, не представляющим опасности при контакте с неповрежденной кожей.

Выполненные исследования по выявлению аллергенного действия показали, что триазавирин не вызывает сенсибилизации организма экспериментальных животных и не является потенциальным аллергеном.

Для оценки мутагенного действия триазавирина использовали метод микроядерного теста. Триазавирин вводили однократно, 500 мг/кг, в брюшную полость. Результаты исследования по выявлению микроядер в клетках костного мозга - полихроматофильных (ПХЭ) и нормохромных эритроцитах (НХЭ) показали, что доза триазавирина 500 мг/кг не оказывает мутагенного эффекта. Данные микроядерного теста обрабатывались методами параметрической и непараметрической статистики (таблица 2).


Таблица 2 - Результаты исследования мутагенного действия триазавирина после введения 500 мг/кг в брюшную полость мышей

Пол

животных

Группы животных

n= 20


n

ПХЭ/НХЭ



Содержание ПХЭ

с микроядрами (ед./500 ПХЭ)

Самцы

контрольная

10

1,390,3

0,9

подопытная

10

1,290,15

p0,05

1,0

p0,05*

Самки

контрольная

10

1,160,13

1,1

подопытная

10

1,190,17

p0,05

1,0

p0,05*



следующая страница >>