litceysel.ru 1 2 3 4


На правах рукописи


БАБАЯН

Анна Юрьевна



Анализ молекулярно-генетических нарушений в генезе рака мочевого пузыря


03.02.07 - генетика


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук


Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Немцова Марина Вячеславовна


Официальные оппоненты:


Носиков Валерий Вячеславович, доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля» Российской академии наук, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-биологических исследований


Завалишина Лариса Эдуардовна, доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации,

ведущий научный сотрудник патологоанатомического отделения


Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации


Защита состоится «08» апреля 2013 г. в 14-00 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.



Автореферат разослан «______»___________________ 2013 г.


Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите диссертаций на соискание ученой

степени кандидата наук, на соискание

ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ежегодно в России регистрируется до 13 тысяч новых случаев рака мочевого пузыря (РМП) (Чиссов В.И. с соавт., 2010). Поверхностный рак мочевого пузыря (ПРМП) составляет 80% всех впервые выявленных случаев РМП, остальные 20% приходятся на инвазивный рак мочевого пузыря (ИРМП). К ПРМП относят неинвазивную папиллярную карциному (Та), карциному in situ (Tis) и опухоли с минимальной инвазией в пределах субэпителиальной соединительной ткани (Т1). К ИРМП относят опухоли, имеющие различную глубину поражения мышечных слоев стенки мочевого пузыря (МП) и прилежащих органов (Т2-Т4). По сравнению с ПРМП, ИРМП характеризуется более агрессивным течением и высокой смертностью (Pasin E. et al., 2008).

ПРМП характеризуется высокой частотой развития рецидивных и множественных опухолей. Частота рецидивирования после хирургического лечения ПРМП составляет до 85%, причем в 30% случаев развиваются диссеминированные и инвазивные формы РМП (Pasin E. et al., 2008). Прогнозирование клинического течения ПРМП и его трансформации в инвазивные формы является важной задачей клинической и молекулярной онкологии.

Клиническая и морфологическая гетерогенность опухолей МП обусловлена их генетической разнородностью. Предполагается существование двух независимых молекулярных путей развития ПРМП и ИРМП. На молекулярно-генетическом уровне ПРМП характеризуется мутациями в протоонкогенах H-RAS, FGFR3, PIK3CA, тогда как ИРМП, напротив, демонстрирует преимущественное повреждение основных генов-супрессоров опухолевого роста, таких как ТР53, RB1 и PTEN (Cordon-Cardo C. et al., 2008; Cheng L. et al., 2011). Данная схема молекулярного патогенеза РМП отражает лишь общие закономерности и оставляет открытыми некоторые вопросы. Остается неясным, развиваются ли ПРМП и ИРМП из общего опухолевого предшественника путем приобретения различных молекулярно-генетических повреждений на более поздних этапах канцерогенеза, или эти два типа РМП возникают и развиваются независимо друг от друга, а также являются ли минимально инвазивные Т1 опухоли самостоятельной группой или переходной стадией от ПРМП к ИРМП.


Решением проблемы клинической гетерогенности РМП может стать выявление характерных для каждого типа РМП высоко специфических маркеров, использование которых в клинике позволило бы отличать опухоли с высоким риском рецидивирования и прогрессии от менее агрессивных новообразований и персонифицировать лечебный подход.

В настоящее время еще недостаточно исследованы причины повышенной частоты рецидивирования и мультифокальности ПРМП. Основным объяснением этого феномена ранее являлось предположение о наличии невыявленных опухолевых узлов на момент постановки диагноза, а также возможности имплантации опухолевых клеток в процессе диагностического или оперативного вмешательства. Считалось, что опухоль развивается из единственной клетки-предшественницы, распространение же ее потомков дает начало множественным опухолям моноклонального происхождения (Simon R. et al., 2001). Исследования последних лет показали, что развитие рецидивных и мультифокальных опухолей может быть объяснено наличием в слизистой МП независимых «полей канцеризации», каждое из которых способно дать начало новой опухоли (Paiss T. et al., 2002; Jones T.D. et al., 2005). Такие опухоли имеют различия, как в молекулярном патогенезе, так и в клиническом поведении. Существование «полей канцеризации» показано для многих видов опухолей человека. Вопрос о клональном происхождении опухолей РМП до сих пор до конца не решен. Его решение позволит оптимизировать медикаментозную и хирургическую тактики лечения РМП.

Необходимость определения дополнительных возможностей в диагностике, прогнозе и лечении РМП, в результате выявления новых молекулярно-генетических маркеров и исследования роли молекулярно-генетических событий в развитии РМП послужили основанием для проведения настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих в процессах возникновения, прогрессии и рецидивирования рака мочевого пузыря, для использования их в качестве дополнительных факторов диагностики и прогноза у пациентов с раком мочевого пузыря.


Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:


  1. Определить наиболее значимые в патогенезе рака мочевого пузыря молекулярно-генетические события и их частоты, и сформировать панель молекулярно-генетических маркеров для дальнейшего исследования.

  2. Выявить ассоциации между исследованными молекулярно-генетическими нарушениями в опухолевой ткани и клинико-морфологическими параметрами поверхностного рака мочевого пузыря (инвазивность, степень дифференцировки, количество узлов, метастазирование) для определения факторов, влияющих на клиническое течение заболевания. Использовать выявленные молекулярно-генетические маркеры для расширения панели прогностических факторов для поверхностного рака мочевого пузыря.

  3. Выявить молекулярно-генетические нарушения в опухолевой ткани, определяющие различия молекулярного патогенеза поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря.

  4. Провести анализ клонального происхождения множественных и рецидивных опухолей при поверхностном раке мочевого пузыря.

  5. Исследовать молекулярно-генетические повреждения, характерные для рака мочевого пузыря в материале условно нормальной ткани слизистой мочевого пузыря с целью оценки ее вовлеченности в процессы злокачественного перерождения.

Научная новизна. В результате проведенного комплексного исследования впервые на российской выборке больных изучены молекулярно-генетические изменения (мутации в гене FGFR3, делеции локусов 3p14, 9p21, 9q34, 17p13, метилирование генов RASSF1A, P16, P14, CDH1, RARβ2, LAMC3, DAPK), происходящие в опухолевой ткани мочевого пузыря и охарактеризованы их частоты. В результате проведенного исследования показана связь молекулярной патологии с клиническим течением заболевания. На основании полученных данных предложены новые молекулярно-генетические маркеры для расширения системы прогноза течения рака мочевого пузыря.

С использованием предложенной панели маркеров, состоящей из структурных и эпигенетических нарушений в геноме опухолевых клеток, показаны различия молекулярного патогенеза поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря.


Определено, что спектр молекулярной патологии в первичных и рецидивных опухолях, а также в мультифокальных опухолях не всегда является идентичным, что дает основание предположить независимое развитие опухолей мочевого пузыря из разных предшественников и подтверждает наличие «полей канцеризации» в слизистой мочевого пузыря. При исследовании паттернов молекулярно-генетических повреждений в образцах рецидивных и множественных опухолей мочевого пузыря показана практически равновероятная возможность развития этих опухолей как в результате моноклонального, так и поликлонального пути канцерогенеза.

Проведено исследование молекулярно-генетических изменений в образцах гистологически нормальной слизистой мочевого пузыря, пограничной с опухолевым очагом, что свидетельствует о вовлеченности пограничной, неопухолевой ткани в процессы канцерогенеза.

Практическая значимость. Проведено комплексное исследование широкого спектра молекулярно-генетических повреждений на материале от 163 пациентов с установленным диагнозом рак мочевого пузыря. Выявлены ассоциации молекулярно-генетических повреждений с такими клиническими характеристиками, как высокий рецидивный и инвазивный потенциал опухоли, низкая степень дифференцировки опухоли, что может позволить использовать анализ данных молекулярных изменений в качестве маркеров течения и прогноза рака мочевого пузыря.

В результате исследования определены дополнительные маркеры неблагоприятного прогноза течения рака мочевого пузыря. Делеции 3р14 и аномальное метилирование генов RARβ2 и CDKN2A ассоциированы с низкой дифференцировкой опухолей, делеции локусов 17р13, 9q34 и метилирование гена CDKN2A у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря достоверно ассоциированы с высоким инвазивным потенциалом. Делеции 9р21 у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря ассоциированы с высоким рецидивным потенциалом опухоли. Напротив, мутации в гене FGFR3 могут являться маркером более благоприятного течения заболевания, так как ассоциированы с поверхностными опухолями и не встречаются при инвазивном раке мочевого пузыря. Предложенные ДНК-маркеры позволяют расширить систему, используемую для прогноза течения рака мочевого пузыря и могут использоваться в дополнение к применяемым диагностическим методам – гистологическому и биохимическому.


На основании полученных результатов разработана и зарегистрирована медицинская ДНК-технология «Молекулярно-генетическая методика оценки риска неблагоприятного течения заболевания у больных поверхностным раком мочевого пузыря» ФС№2009/311 от 04.09.2009. Данная медицинская технология предназначена для анализа молекулярно-генетических нарушений при раке мочевого пузыря и позволяет проводить скрининг и оценивать прогноз заболевания на ранних этапах его возникновения, определять риск рецидивирования в период лечения и корректировать тактику терапии в случае инактивации определенных генов.

Возможность олигоклонального происхождения опухолей мочевого пузыря и вовлеченность нормальной слизистой позволяют рассматривать рак мочевого пузыря как комплексное заболевание слизистой мочевого пузыря и обосновывают необходимость разработки новых способов комплексной терапии рака мочевого пузыря.

Апробация работы. Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2008 г. (г. Барселона, Испания), в 2009 г. (г. Вена, Австрия), в 2010 г. (г. Гетеборг, Швеция), в 2012 г. (г. Нюрнберг, Германия); на Европейской мультидисциплинарной конференции по урологическим ракам в 2009 г. (г. Барселона, Испания); на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2008 г. (г. Москва, Россия); на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 г. (г. Москва, Россия); на российских онкоурологических конгрессах в 2008-2011 г. (г. Москва, Россия); на Пироговской студенческой научной медицинской конференции в 2008-2009 г.г. (г. Москва, Россия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ: одна медицинская технология, 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ, 9 работ в материалах конгрессов и конференций в РФ и 6 зарубежом.

Внедрение результатов исследования в клиническую практику. Результаты проведенных научных исследований внедрены в практическую работу лаборатории эпигенетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук. Использование основных положений диссертации позволило дополнить и расширить общепринятую систему клинико-морфологических факторов прогноза течения рака мочевого пузыря молекулярно-генетическими маркерами.


По результатам диссертационной работы разработана и зарегистрирована медицинская ДНК-технология «Молекулярно-генетическая методика оценки риска неблагоприятного течения заболевания у больных поверхностным раком мочевого пузыря». ФС№2009/311 от 04.09.2009.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 ссылки. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками.

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие в проведении молекулярно-генетический исследований, анализе клинических и лабораторных данных, статистической обработке полученных результатов, также участвовал в разработке дизайна исследования. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов и формулировка выводов выполнены автором самостоятельно.

Положения, выносимые на защиту


  1. Мутации в гене FGFR3, делеции локусов 9p21, 9q34, 3p14, 17p13, и аберрантное метилирование промоторных районов генов RASSF1A, CDKN2A, p14ARF, CDH1, RARβ2, LAMC3, DAPK являются значимыми событиями для патогенеза опухолей мочевого пузыря, и легли в основу системы молекулярно-генетических маркеров для исследования рака мочевого пузыря.
  2. Высокая прогностическая значимость в качестве маркеров течения поверхностного рака мочевого пузыря показана для мутаций гена FGFR3, делеций локусов 3р14, 9р21 и метилирования генов RARβ2 и Р16: делеция локуса 9р21 в клетках первичной уротелиальной карциномы является маркером высокого рецидивного потенциала, делеции локуса 3р14 и метилирование генов RARβ2 и P16 ассоциированы со снижением степени опухолевой дифференцировки, мутации гена FGFR3 являются благоприятным прогностическим признаком.


  3. Использование панели молекулярно-генетических маркеров для характеристики поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря позволяет предположить различный молекулярный патогенез этих типов рака мочевого пузыря: делеции локусов 17р13 (ген ТР53) и 9q34 и метилирования гена Р16 у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря свидетельствует о высоком инвазивном потенциале опухоли и является маркером негативного течения заболевания; индекс метилирования, при использовании его в качестве маркера инвазии, обладает высокой прогностической значимостью.

  4. Исследование панели молекулярно-генетических маркеров в рецидивных и первично-множественных опухолях мочевого пузыря выявляет различие спектров молекулярных повреждений в них и подтверждает возможность развития рака мочевого пузыря, как по моноклональному, так и по поликлональному типу.

  5. В морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевым очагом, происходит накопление молекулярных изменений, подобных изменениям в опухолевой ткани, что может свидетельствовать о вовлеченности пограничной неопухолевой ткани в процессы канцерогенеза и формирования «поля канцеризации» в слизистой мочевого пузыря.




следующая страница >>