litceysel.ru
добавить свой файл
1 2 3


На правах рукописи


Купрашвили Иосиф Тамазович


Экспериментальное изучение эффективности клеточной трансплантации при посттравматической патологии сетчатки


14.00.08 – глазные болезни

14.00.16 – патологическая физиология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


Москва – 2009


Работа выполнена в ФГУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца Росмедтехнологий» (директор – доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Нероев Владимир Владимирович).


Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ченцова Екатерина Валериановна


доктор биологических наук, профессор Зуева Марина Владимировна


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Саакян Светлана Владимировна


доктор биологических наук Белкина Людмила Михайловна


Ведущая организация: ГУ НИИ Глазных болезней РАМН.


Защита состоится 12 мая 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.042.01 при ФГУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий»

(105062, Москва, ул. Садовая - Черногрязская, 14/19)


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

ФГУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий»


Автореферат разослан « ___ » апреля 2009 года.


Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Филатова И.А

Общая характеристика работы.


Актуальность проблемы.

Несмотря на постоянные поиски и усовершенствование медикаментозной терапии, появление лазерного и современных хирургических методов лечения, патология сетчатки остается одной из ведущих причин необратимого снижения зрения, в основе которого лежит снижение обменных и восстановительных процессов, нарушение микроциркуляции, нарушение структурной организации сетчатки. В связи с этим, поиск новых патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний сетчатки является актуальным. В последние годы появился кардинально новый подход к лечению заболеваний сетчатки на основе клеточных технологий, что во многом обусловлено активным изучением стволовых клеток (СК), как более перспективного клеточного материала для трансплантации. Целью трансплантаций СК является: замещение нефункционирующей или дефектной ткани или клеточной популяции; стимуляция собственных СК организма и усиление репаративной регенерации; адресная доставка генетических конструкций, биомолекул и лекарственных средств. В экспериментах показано, что небольшое количество высокоспециализированных клеток может компенсировать функцию поражённого органа. Будучи трансплантированными, стволовые клетки способны приживляться и дифференцироваться в зависимости от микроокружения. Эти клетки способны значительно повысить адаптивные возможности организма за счет усиления процессов физиологической и репаративной клеточной регенерации (Сухих Г.Т., 1998). При соблюдении определенных условий, трансплантация стволовых клеток не вызывает иммунных реакций, направленных на отторжение донорских клеток. Это подразумевает возможность применения трансплантационных клеточных технологий для лечения стволовыми клетками без использования иммуносупрессивной терапии.


Представляется важной с медицинской точки зрения способность низкодифференцированных клеток тормозить, а в некоторых случаях реверсировать, развитие грубоволокнистой соединительной ткани. Такое торможение создает важные дополнительные предпосылки для эффективного восполнения клеточных потерь организма новыми функционально-полноценными клетками (Fawcett J.W., 1998;). Отсюда следует перспективность и целесообразность попыток использования клеточных технологий в лечении целого ряда заболеваний, обусловленных старением организма. Трансплантация низкодифференцированных стволовых клеток может способствовать восстановлению кровотока в ишемизированных органах и тканях. (Murohara et al.,2000; Fuch et al., 2001).

Среди множества методов и направлений, наиболее перспективной для внедрения в клинику, на наш взгляд, является трансплантация аутологичных (собственных) стволовых/прогениторных клеток пациента, выделенных из разных тканей и органов.

Одним из самых перспективных видов аутологичного материала для клеточной терапии и тканевой инженерии считаются мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (МСПК) и нейрональные стволовые клетки (НСПК), выделенные из обонятельной области слизистой оболочки носа взрослого человека. Опубликованные работы свидетельствующие, что при определенной подготовке МСПК могут быть успешно трансплантированы RCS крысам: встраиваясь в сетчатку реципиента, клетки дифференцируются в зрелые нейроны, выделяя характерные маркеры: виментин, калбиндин, родопсин, GFAP. Обонятельный эпителий является доступным и, на сегодняшний день, единственным  источником аутологических нейрональных стволовых, прогениторных и обкладочных глиальных клеток, трансплантация которых открывает новые перспективы в лечении  патологии  сетчатки, а также ряда дегенеративных заболеваний центральной и периферической нервной системы человека.

Цель работы: изучить влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стволовых/прогениторных клеток костного мозга (МСПК) и нейрональных стволовых/прогениторных клеток (НСПК), выделенных из обонятельной области слизистой оболочки носа взрослого человека, на процессы репарации, регенерации и сохранность функциональной активности сетчатки после ее повреждения в эксперименте.


Задачи:

1. Определить способы и дозы введения клеточных культур с последующей оценкой безопасности трансплантации СК в глаза кроликов.

2. Изучить воздействие МСПК на модели лазерного повреждения сетчатки у кроликов с помощью клинических, электрофизиологических и гистологических методов исследования.

3. Определить эффективность трансплантации НСПК на моделях лазерного повреждения сетчатки и ретинальной ишемии у кроликов с использованием клинических, электрофизиологических и гистологических методов исследования.

4. Провести анализ полученных результатов с оценкой перспективности внедрения в клиническую офтальмологию.


Научная новизна:

1. Определены безопасные и наиболее эффективные дозы и способы введения нейрональных СК, выделенных из обонятельной области слизистой носа и культивированных мезенхимальных СК, выделенных из костного мозга.

2. На фоне лазеркоагуляции сетчатки супрахориоидальная трансплантация МСПК и НСПК ведет к статистически достоверному уменьшению размера очагов лазерного поражения сетчатки, а также суммарного (среднего) размера зон первичного лазерного поражения. Меньшая площадь повреждения в опытных глазах при одинаковых условиях лазеркоагуляции доказывает, что супрахориоидальная трансплантация СК стимулирует репаративные процессы в сетчатке и защищает ее от развития вторичных дистрофических изменений.

3. При моделировании очагового повреждения сетчатки лазерной коагуляцией характерна большая выраженность угнетения функции фоторецепторов, чем пострецепторных нейронов. Динамика ЭРГ на стимулы различной интенсивности свидетельствует, что этот факт может быть связан с нарушением кинетики регенерации зрительных пигментов, которое выражено значительно в меньшей степени при супрахориоидальном введении МСПК.

4. Сравнительный анализ результатов исследований показал схожие закономерности в развитии влияния на электрогенез сетчатки супрахориоидальной трансплантации СК различного происхождения – мезенхимальных и обкладочных, которые состоят в защите функции и структуры нейронов сетчатки – нейропротекторном эффекте – в ранний период развития ретинальной патологии и в ускорении процесса восстановления ретинальной функции в отдаленном периоде наблюдения.


5. На ранних сроках после моделирования лазерного повреждения нейропротекторный эффект при трансплантации МСПК наиболее выражен для функции фоторецепторов, а при введении НСПК – не только для функциональной активности фоторецепторов, но и клеток Мюллера.

Практическая значимость:

1. Показано, что для повышения репаративной и функциональной активности сетчатки при ее патологии различного генеза целесообразно применение культивированных нейрональных СК, выделенных из обонятельной области слизистой носа и культивированных мезенхимальных СК, выделенных из костного мозга.

2. Установлено, что оптимальным методом трансплантации СК является их введение в супрахориоидальное пространство в количестве 500 тыс. в 0,02 мл физиологического раствора.

3. Использование МСПК и НСПК может служить основой для разработки новых перспективных стратегий в офтальмотравматологии, и целесообразно дальнейшее изучение их возможностей в качестве средств нейропротекции или альтернативных терапевтических приемов при лечении последствий заболеваний сетчатки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальным методом трансплантации культивированных нейрональных СК, выделенных из обонятельной области слизистой носа (НСПК) и культивированных мезенхимальных СК, выделенных из костного мозга (МСПК), является их введение в супрахориоидальное пространство в количестве 500 тыс. в 0,02 мл физиологического раствора.

2. Супрахориоидальная трансплантация СК стимулирует репаративные процессы в сетчатке и защищает ее от развития вторичных дистрофических изменений при лазерном повреждении, что выражается меньшей площадью повреждения и меньшей степенью нарушения электрогенеза сетчатки по сравнению с контрольной группой.

3. В результате комплексных электроретинографических и гистологических исследований установлено, что супрахориоидальное введение НСПК и МСПК в указанных дозах оказывает нейропротекторное воздействие, наиболее выраженное для функции фоторецепторов и клеток Мюллера в ранние сроки после моделирования лазерного повреждения сетчатки кроликов или ретинальной ишемии. На отдаленных сроках трансплантация стволовых/прогениторных клеток способствует ускорению процесса восстановления функции сетчатки. Большая степень возрастания амплитуды ЭРГ и РЭРГ коррелирует с данными гистологических исследований


Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «Федоровские чтения» (Москва, 2007 и 2008), VII симпозиуме международного общества по глазной травме (Рим, Италия, 2006), II Всероссийской научной конференции молодых ученых (Москва, 2007), объединенном конгрессе SOE/AAO (Вена, Австрия, 2007), в Британском посольстве на конференции «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества», 2007, на Ученом Совете МНИИ ГБ, май 2007, VIII симпозиуме международного общества по глазной травме (Вёрсбург, Германия, 2008).


Публикации:

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 в центральной печати и 4 в зарубежной литературе. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение от 01.04.09. по заявке №2008121546/14 (приоритет от 29.05.08.).


Структура и объем диссертации.

Работа изложена на 125 страницах машинописи, иллюстрирована 47 рисунками, 4 таблицами. Список литературы включает 121 источника, из них 40 отечественных и 81 иностранных.



следующая страница >>